RESUMO

ABSTRACT: Pseudorabies (PR) is a highly contagious viral disease of great animal health and economic importance in swine industry. The aim of this study was to evaluate different genomic regions, real-time PCR chemistries and equipment for the molecular diagnosis of PR. Eight primer pairs targeting four genes (gB, gC, gE, gD), three different qPCR chemistries (SybrGreen, hydrolysis probes and plexor) and two equipment (ABI7500, Rotorgene 3000) were evaluated. Oligonucleotides targeting gB using hydrolysis probes showed the best performance after evaluating efficiency (99%), the detection limit (10-1.5 TCID50 mL-1) and diagnostic sensitivity and; therefore, those primers were selected for performance verification factors such as repeatability, reproducibility and robustness (1.39% variance between days, 24% variance between analysts and 4.07% variance in analysis error). The qPCR standardized and validated in this research proved to be reliable for the diagnosis of PR and may be used in diagnostic laboratories that follow ISO 17025 and ISO 16140.

RESUMO: Pseudorraiva (PR) é uma doença viral altamente contagiosa de grande importância sanitária e econômica na indústria suína. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes regiões genômicas, químicas de PCR em tempo real e equipamentos para o diagnóstico molecular de PR. Foram avaliados quatro genes (GB, GC, GE, gD), três diferentes produtos químicos (SybrGreen, sondas de hidrólise e plexor) e dois equipamentos (ABI7500, Rotorgene 3000). Oligonucleotídeos com alvo para gB baseados na química de sondas de hidrólise apresentaram o melhor desempenho nos testes de eficiência (99%), de limite de detecção (10-1.5 TCID50 mL-1) e sensibilidade diagnóstica. Portanto, estes foram selecionados para fatores de verificação de desempenho, tais como a repetibilidade, reprodutibilidade e robustez (1,39% de variância entre dias, 24% variância entre analistas e 4,07% de variância por erro de análise). A qPCR, padronizada e validada neste trabalho, mostrou-se confiável para o diagnóstico de PR e pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico que se seguem normas internacionais como ISO 17025 e ISO 16140.

RESUMO

Para avaliar diferentes protocolos da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) para diagnóstico da anemia infecciosa equina (AIE), foram utilizados dois kits comerciais de IDGA: kit A importado e kit B fabricado no Brasil. O kit A foi submetido aos protocolos recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). O kit B, nacional, foi submetido somente ao protocolo recomendado pelo MAPA e foi utilizado como referência nesse estudo. Foi utilizado um total de 345 amostras de soro que incluiu amostras de campo, amostras de laboratórios oficiais e controle fraco positivo proveniente do National Veterinary Services Laboratories (NVSL, EUA). Foram avaliados parâmetros tais como a sensibilidade do kit A nos dois protocolos, o limite de detecção dos kits e a ocorrência de reações não específicas ou não-identidade. O teste IDGA com o kit A, quando realizado de acordo com o protocolo recomendado pelo OIE, demonstrou boa concordância com o kit B e 99% de sensibilidade relativa. No entanto, quando o kit A foi executado com o protocolo recomendado pelo MAPA, houve falha na detecção de 1,16% de amostras fracas positivas, e sua sensibilidade relativa diminuiu para 96%. O limite de detecção do kit A foi menor do que o limite de detecção do kit B para amostras fracas positivas em ambos os protocolos. A ocorrência de reações inespecífi

To evaluate the Equine Infectious Anemia (EIA) agar gel immunodiffusion (AGID) protocols, two different kits commercially available in Brazil were used: an imported kit (kit A) and a domestically produced kit (kit B). Kit A was submitted to the protocols recommended by the World Organization for Animal Health (OIE) and the protocol recommended by the Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Kit B, the Brazilian kit, was submitted only to the MAPA-recommended protocol and was used as a reference in this study. A total of 345 equid serum samples, including field samples, serum sets from official laboratories and a weak positive serum control from National Veterinary Services Laboratories (NVSL), were used. Parameters such as the sensitivity of kit A in the two protocols, the detection limit of kits and the occurrence of nonspecific reactions or non-identity were evaluated. When Kit A was used for an AGID procedure performed according to the OIE-recommended protocol, the kit demonstrated good agreement with kit B and 99 % relative sensitivity. However, when kit A was processed according to the MAPA-recommended protocol, it failed to detect 1.16 % of weak positive samples and its relative sensitivity decreased to 96 %. The detection limit of kit A was lower than the detection limit of kit B for weak positive samples in both protocols. The occurrence of nonidentity

RESUMO

Para avaliar diferentes protocolos da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) para diagnóstico da anemia infecciosa equina (AIE), foram utilizados dois kits comerciais de IDGA: kit A importado e kit B fabricado no Brasil. O kit A foi submetido aos protocolos recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). O kit B, nacional, foi submetido somente ao protocolo recomendado pelo MAPA e foi utilizado como referência nesse estudo. Foi utilizado um total de 345 amostras de soro que incluiu amostras de campo, amostras de laboratórios oficiais e controle fraco positivo proveniente do National Veterinary Services Laboratories (NVSL, EUA). Foram avaliados parâmetros tais como a sensibilidade do kit A nos dois protocolos, o limite de detecção dos kits e a ocorrência de reações não específicas ou não-identidade. O teste IDGA com o kit A, quando realizado de acordo com o protocolo recomendado pelo OIE, demonstrou boa concordância com o kit B e 99% de sensibilidade relativa. No entanto, quando o kit A foi executado com o protocolo recomendado pelo MAPA, houve falha na detecção de 1,16% de amostras fracas positivas, e sua sensibilidade relativa diminuiu para 96%. O limite de detecção do kit A foi menor do que o limite de detecção do kit B para amostras fracas positivas em ambos os protocolos. A ocorrência de reações inespecífi

To evaluate the Equine Infectious Anemia (EIA) agar gel immunodiffusion (AGID) protocols, two different kits commercially available in Brazil were used: an imported kit (kit A) and a domestically produced kit (kit B). Kit A was submitted to the protocols recommended by the World Organization for Animal Health (OIE) and the protocol recommended by the Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Kit B, the Brazilian kit, was submitted only to the MAPA-recommended protocol and was used as a reference in this study. A total of 345 equid serum samples, including field samples, serum sets from official laboratories and a weak positive serum control from National Veterinary Services Laboratories (NVSL), were used. Parameters such as the sensitivity of kit A in the two protocols, the detection limit of kits and the occurrence of nonspecific reactions or non-identity were evaluated. When Kit A was used for an AGID procedure performed according to the OIE-recommended protocol, the kit demonstrated good agreement with kit B and 99 % relative sensitivity. However, when kit A was processed according to the MAPA-recommended protocol, it failed to detect 1.16 % of weak positive samples and its relative sensitivity decreased to 96 %. The detection limit of kit A was lower than the detection limit of kit B for weak positive samples in both protocols. The occurrence of nonidentity

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The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.

O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.

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The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.

O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.

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The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.

O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.

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The occurrence of Mycoplasma spp as contaminant of cell cultures in cell culture laboratories of the Escola de Veterinária da UFMG and of the Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais was obtained by the use of a fast DNA extraction protocol e by the use of PCR. The PCR sensitivity and specificity were evaluated. The search for Mycoplasmas DNA was done in 83 cell lines samples. We found infected cell lines in both laboratories. The quality of extracted DNA was verified using a beta-actin gene PCR. The Mycoplasmass PCR showed to be fast, sensitive and specific. KEY WORDS: Beta-actin, cell, culture, Mycoplasma spp, PCR.

A ocorrência de Mycoplasma spp como contaminante de cultivos celulares nos laboratórios de cultivo celular da Escola de Veterinária da UFMG e do Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais foi estabelecida através da implementação de um protocolo rápido de extração de DNA e pela utilização da PCR. Avaliaram-se a sensibilidade e especificidade da PCR. Realizou-se pesquisa de DNA de Mycoplasmas em 83 amostras de linhagens celulares e encontraram-se linhagens infectadas nos dois laboratórios avaliados. A qualidade do DNA extraído foi verificada utilizando-se a PCR para o gene da beta-actina. A pesquisa de Mycoplasmas por PCR mostrou-se rápida, sensível e específica.PALAVRAS-CHAVES: Beta-actina, celular, cultivo, Mycoplasma spp, PCR.

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The occurrence of Mycoplasma spp as contaminant of cell cultures in cell culture laboratories of the Escola de Veterinária da UFMG and of the Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais was obtained by the use of a fast DNA extraction protocol e by the use of PCR. The PCR sensitivity and specificity were evaluated. The search for Mycoplasmas DNA was done in 83 cell lines samples. We found infected cell lines in both laboratories. The quality of extracted DNA was verified using a beta-actin gene PCR. The Mycoplasmass PCR showed to be fast, sensitive and specific. KEY WORDS: Beta-actin, cell, culture, Mycoplasma spp, PCR.

A ocorrência de Mycoplasma spp como contaminante de cultivos celulares nos laboratórios de cultivo celular da Escola de Veterinária da UFMG e do Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais foi estabelecida através da implementação de um protocolo rápido de extração de DNA e pela utilização da PCR. Avaliaram-se a sensibilidade e especificidade da PCR. Realizou-se pesquisa de DNA de Mycoplasmas em 83 amostras de linhagens celulares e encontraram-se linhagens infectadas nos dois laboratórios avaliados. A qualidade do DNA extraído foi verificada utilizando-se a PCR para o gene da beta-actina. A pesquisa de Mycoplasmas por PCR mostrou-se rápida, sensível e específica.PALAVRAS-CHAVES: Beta-actina, celular, cultivo, Mycoplasma spp, PCR.

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A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma nested-PCR (nPCR) um teste imunoenzimático (ELISA) e a imunodifusão emgel de agar (IDGA) foram utilizados para identificar bovinos Pantaneiros naturalmente infectados pelo vírus da leucemia bovina(BLV), e os resultados dos quatro testes comparados. A concordância entre os testes foi de 86,2%, 70,0% e 62,5%, respectivamentepara ELISA/IDGA, IDGA/PCR e ELISA/PCR. A nPCR amplificou DNA proviral de 12 amostras negativas à PCR e de quatrobovinos com resultados negativos em testes sorológicos; entretanto, não amplificou o DNA proviral de quatro amostras debovinos soropositivos.

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A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma nested-PCR (nPCR) um teste imunoenzimático (ELISA) e a imunodifusão emgel de agar (IDGA) foram utilizados para identificar bovinos Pantaneiros naturalmente infectados pelo vírus da leucemia bovina(BLV), e os resultados dos quatro testes comparados. A concordância entre os testes foi de 86,2%, 70,0% e 62,5%, respectivamentepara ELISA/IDGA, IDGA/PCR e ELISA/PCR. A nPCR amplificou DNA proviral de 12 amostras negativas à PCR e de quatrobovinos com resultados negativos em testes sorológicos; entretanto, não amplificou o DNA proviral de quatro amostras debovinos soropositivos.