RESUMO
We aimed to elucidate whether NO acts in in vitro sperm capacitation in bovine via cGMP/PKG1 pathway. For this, cryopreserved bovine sperm were capacitated in vitro with 20 µg/ml heparin (Control) plus treatments: 1 mM L-arginine (L-arg, NO precursor), 50 µM Rp-8-Bromo-ß-phenyl-1,N2 -ethenoguanosine-3',5'-cyclic monophosphorothioate (Rp-8-Br-cGMPS, selective inhibitor of the binding site for cGMP in PKG1), 1 mM 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO, NO scavenger), and the combinations of L-arg + RP-8-Br-cGMPS and L-arg + PTIO. Sperm motility and vigour were determined by phase-contrast microscopy, capacitation status by chlortetracycline staining, and the intracellular concentration of cGMP was measured by ELISA. Data were subjected to analysis of variance and means compared with SNK test at 5% probability. Motility and vigour were lower in sperm treated with PTIO when compared to Control and other treatments (p < .05). The L-arg treatment showed the highest percentage of capacitated sperm when compared to the Control and other treatments (Rp-8-Br-cGMPS, L-arg + Rp-8-Br-cGMPS and PTIO) (69.8 ± 3.4%, 51.2 ± 3.0, 51.1 ± 2.1, 51.2 ± 3.0 and 45.5 ± 2.7, respectively) (p < .05). The capacitation ratio (%) was lower in treatments with Rp-8-Br-cGMPS, L-arg + Rp-8-Br-cGMPS and PTIO, respectively (p < .05). Lastly, cGMP concentration (pmol/ml) was lower in PTIO and L-arg + PTIO (1.3 ± 0.3 and 1.6 ± 0.4) and was higher in Rp-8-Br-cGMPS and L-arg + Rp-8-Br-cGMPS (3.7 ± 0.4 and 4.0 ± 0.5) treatments. We showed that during in vitro capacitation of cattle: (a) NO influences sperm motility and vigour; (b) NO is associated with cGMP synthesis through two independent pathways and (c) the cGMP/PKG1 pathway has a partial role in sperm capacitation and does not involve the L-arg/NO.
Assuntos
GMP Cíclico/fisiologia , Óxido Nítrico/farmacologia , Capacitação Espermática/efeitos dos fármacos , Motilidade dos Espermatozoides/efeitos dos fármacos , Animais , Arginina/farmacologia , Bovinos , Criopreservação/veterinária , GMP Cíclico/análogos & derivados , GMP Cíclico/farmacologia , Proteínas Quinases Dependentes de GMP Cíclico/fisiologia , Óxidos N-Cíclicos/farmacologia , Heparina/farmacologia , Imidazóis/farmacologia , Masculino , Espermatozoides/efeitos dos fármacos , Espermatozoides/fisiologia , Tionucleotídeos/farmacologiaRESUMO
[...] O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do óxido nítrico (NO), a via L-arg/NO/GMPc e mecanismos de ação na qualidade da capacitação in vitro de espermatozoides bovinos criopreservados, por meio da adição da L-arginina (L-arg, precursora da síntese de NO), 1H-(1,2,4) oxadiazolo-(4,3-a) quinoxalin-1-ona (ODQ, inibidor da guanilato ciclase solúvel, GCs) e 8-Br-GMPc (Br-GMPc, análogo do GMPc) e seu reflexo na produção in vitro de blastocistos. No experimento 01 foram adicionadas diferentes concentrações de L-arg (1; 2,5; 5; 10 e 50 mM ); ODQ (0,1 mM) e Br-GMPc (5 e 10 mM) ao meio capacitante. A motilidade e o vigor foram avaliados de forma subjetiva com microscopia de luz indireta, a integridade de membrana plasmática (MP), acrossomal (MA) e o potencial mitocondrial (PM) foram avaliados pela associação de 4 probes fluorescentes (iodeto de propídio, IP; hoescht; aglutinina de Pisum sativum conjugada ao isotiacianato de fluoresceína, FITC-PSA e 5,5?,6,6??tetracloro-1,1,3,3??tetraetilbenzimidazolil carbocianina (JC1) e a concentração de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelo método de Griess após 4 h de capacitação. A adição de 1 mM de L-arg aumentou a síntese de NO (42,7%), a motilidade progressiva (10,2%), o vigor (15,4%) e a integridade de MP, MA e PM (43,4%) semelhante ao aumento obtido após a adição de 5 mM de Br-GMPc para todos os parametros avaliados (P<0,05). A adição de 0,1 mM de ODQ diminuiu a síntese de NO (13,6%), a motilidade progressiva (55%), o vigor (34,6%) e a integridade de MP, MA e PM (84,4% - P<0,05). No experimento 02, foi avaliada a concentração de glutationa no espermatozoide (glutathione assay kit CS0260) e a peroxidação lipídica (Kit PeroxiDetectTM ? PD1) após a capacitação (4 h) com a concentração de L-arg que apresentou efeito estimulatório (1mM) e efeito inibitório (10 mM) no experimento 01, ODQ (0,1 mM) e Br-GMPc (5 e 10 mM).