RESUMO
The variable regions from P3, a murine monoclonal antibody (MAb) against NeuGc-containing gangliosides, and two anti-idiotype MAbs directed to P3 MAb were cloned and sequenced. Comparisons with previously reported sequences showed that P3 is a germline antibody encoded by genes from the V(H)Q52 and V(kappa)19 families. Analysis of nucleotides at the heavy chain CDR3 (H-CDR3) showed the presence of an extensive 3' N region that contains almost 50% of the nucleotides of this CDR. In addition, amino acid sequence analysis of the H-CDRs of this MAb revealed the presence of three arginines, two of which are present in the H-CDR3, that could be involved in the interaction of P3 MAb with its electronegative epitope on gangliosides. Anti-idiotype 1E10, which seems to define a "regulatory" idiotope on P3 MAb (it induces Id+ Ab3), represents a germline Ab2 that belongs to the V(H)J558 and V(kappa)10 gene families. By contrary, the anti-idiotype 3B11 is an extensively mutated antibody that belongs to the V(H)3660 and V(kappa)4/5 gene families, defining a "private" idiotope on P3 MAb. Even when different V genes contribute to the variable regions of 1E10 and 3B11 MAbs, they share an acidic motif E/D-D-Y/D-Y-D in H-CDR3, suggesting that both Ab2s recognize paratope positive residues on the Ab1. Therefore, complementary electrostatic interactions involving H-CDR3 from both Ab1 and Ab2, might provide a clue to understand the molecular basis for the generation of gamma-type anti-idiotype antibodies to V regions recognizing glycolylated ganglioside antigens.
Assuntos
Anticorpos Monoclonais/genética , Gangliosídeo G(M3)/análogos & derivados , Gangliosídeo G(M3)/imunologia , Região Variável de Imunoglobulina/genética , Sequência de Aminoácidos , Animais , Especificidade de Anticorpos , Sequência de Bases , Regiões Determinantes de Complementaridade/genética , Primers do DNA/química , Epitopos/análise , Humanos , Imunogenética , Cadeias Pesadas de Imunoglobulinas/genética , Idiótipos de Imunoglobulinas/análise , Idiótipos de Imunoglobulinas/genética , Cadeias Leves de Imunoglobulina/genética , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Dados de Sequência Molecular , Reação em Cadeia da Polimerase , Homologia de Sequência de Aminoácidos , Homologia de Sequência do Ácido NucleicoRESUMO
Several approaches have been developed to reduce the human immune response to nonhuman antibodies. However, chimeric antibodies and humanized antibodies often have decreased binding affinity. We described a new approach for reducing the immunogenicity of chimeric antibodies while maintaining the affinity. This approach seeks to prevent the recognition of murine immunogenic peptides from the antibody variable region by human lymphocytes. Putative immunogenic epitopes in the variable region are identified and subjected to site directed mutagenesis to make them human and/or to break the amphipathic motifs. The R3 antibody, which blocks the epidermal growth factor (EGF) receptor, was used as a model system to test this approach. Four segments containing possible amphipathic epitopes were found in the heavy variable domain using the program AMPHI. Six amino acids within two of these segments were substituted by the corresponding residues from a homologous human sequence. No mutations were made in the murine light variable domain. Experiments in monkeys suggested that the "detope" R3 antibody was less immunogenic than its chimeric analogue. A search for possible amphipathic epitopes in the Kabat database revealed the presence of conserved patterns in the different families of variable region sequences, suggesting that the proposed method may be of general applicability.
Assuntos
Anticorpos/genética , Anticorpos/farmacologia , Epitopos/imunologia , Engenharia de Proteínas , Algoritmos , Animais , Anticorpos/imunologia , Especificidade de Anticorpos , Chlorocebus aethiops , Regiões Determinantes de Complementaridade/imunologia , Epitopos/química , Receptores ErbB/imunologia , Humanos , Imunização , Camundongos , Dados de Sequência Molecular , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/imunologia , Proteínas Recombinantes de Fusão/farmacologia , Homologia de Sequência de AminoácidosRESUMO
BACKGROUND: Antibody humanization by transplanting the complementarity determining regions (CDRs) of a murine antibody to a human framework aims to reduce the response of the human immune system against a foreign molecule. Frequently, however, some murine amino acids from the framework have to be retained to recover binding affinity. OBJECTIVES: To redesign R3, a mouse monoclonal antibody (mAb) that binds the human epidermal growth factor (EGF)-receptor and inhibits the binding of EGF, to be a human IgG1. STUDY DESIGN: The light and heavy chains of REI and Eu, respectively, were selected as human immunoglobulin (Ig) frameworks for CDR-grafting based on their high homology with the corresponding sequences of murine R3. Molecular modeling was used to analyze the possible effects of mutating murine residues that underlie the CDRs. RESULTS: CDR-grafting dramatically reduced the binding capability of the antibody. Molecular modeling suggested that two amino acids (Thr 76 and Thr 93), among five immunoglobulin heavy chain variable region (VH) residues underlying the CDRs, were critical for antigen binding. The five residues were mutated back to the original murine amino acids in different combinations contained in six variants of humanized antibodies. In agreement with molecular modeling analysis. The variant in which three murine residues were retained (Ser 75, Thr 76 and Thr 93) exhibited a similar capacity to inhibit the binding of 125I-labeled EGF to its receptor as compared with the original antibody. This humanized antibody was at least 2-fold less immunogenic in African Green monkeys than the chimeric antibody. CONCLUSIONS: Only very few mutations in the frameworks may be necessary to recover the binding capability of a humanized antibody. Molecular modeling can serve as a powerful tool to identify residues critical for binding.
Assuntos
Anticorpos Monoclonais/imunologia , Receptores ErbB/imunologia , Proteínas Recombinantes de Fusão/imunologia , Sequência de Aminoácidos , Animais , Anticorpos Monoclonais/genética , Clonagem Molecular , Fator de Crescimento Epidérmico/metabolismo , Receptores ErbB/genética , Receptores ErbB/metabolismo , Engenharia Genética , Humanos , Imunoglobulina G/imunologia , Cadeias Pesadas de Imunoglobulinas/genética , Cadeias Pesadas de Imunoglobulinas/imunologia , Região Variável de Imunoglobulina/genética , Região Variável de Imunoglobulina/imunologia , Camundongos , Camundongos Nus , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismoRESUMO
Addition of high concentrations (100ng/ml) of epidermal growth factor (EGF) to cultures of the epidermoid-carcinoma cell-line A431, which expresses high levels of the EGF receptor, resulted in 50 percent reduction in growth rate. At a lower level (10 ng/ml) of EGF no such inhibitory effect was observed. Addition of gamma-interferon at a concentration of 100 u/ml, but not alpha-interferon at the same concentration. inhibited the growth rate of A431 cells by 50 percent. Incubation of the cells in medium containing both 10 ng/ml of EGF and 1000 u/ml of gamma-interferon led to a complete growth arrest. After 48 hours this inhibition was not reversible and resulted in excessive cell-death after approximately seven days. The human lung cancer cell-line U-1752, which expresses low levels of the EGF receptor, was not inhibited by EGF even at high concentrations. Gamma-interferon did not increase the sensitivity of these cells to EGF. The results show that the modulating effect of gamma-interferon on EGF activity is variable and probably depends on cell line, receptor concentration as well as the primary effect of EGF on different cells.
Assuntos
Fator de Crescimento Epidérmico/farmacologia , Interferon gama/farmacologia , Carcinoma de Células Escamosas/patologia , Divisão Celular/efeitos dos fármacos , Sinergismo Farmacológico , Receptores ErbB/análise , Feminino , Humanos , Células Tumorais Cultivadas/efeitos dos fármacos , Neoplasias Vulvares/patologiaRESUMO
El factor de crecimiento epidérmico (EGF), polipéptido mitogénico para células de origen epitelial y mesenquimatoso tiene, sin embargo, un efecto inhibidor de la proliferación in vitro de las células de muy alto contenido de receptores. Los resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado que el EGF podía inhibir in vivo la incorporación de timidina en células del tumor ascítico de Ehrlich. En este artículo presentamos una evaluación directa del efecto del EGF (humano, recombinante) en el crecimiento de tumores trasplantables de ratón y de xenotrasplantes de tumores humanos en ratones atímicos. Los tumores de Ehrlich (carcinoma mamario), RL-67 (carcinoma de pulmón) y CETA (carcinoma epidermoide de labio), fueron los tumores con mayor contenido de receptores de EGF dentro de nuestro banco de tumores trasplantables. En estos modelos, no obstante, el EGF (20 mg/kg/día, subcutáneo, 10 días) no mostró efecto inhibidor del crecimiento tumoral. Sin embargo, en los tumores humanos obtenidos por xenotrasplantes en ratones atímicos de células de carcinoma de vulva (A431) y fragmentos de carcinoma epidermoide de pulmón (CPH3), la administración de EGF produjo una inhibición del crecimiento tumoral. Este efecto fue reversible cuando se interrumpió el tratamiento. Estos resultados indican la posibilidad de regular in vivo el crecimiento de tumores con receptores de EGF, mediante la administración de este factor en dosis muy superiores a las concentraciones fisiológicas, lo cual constituye potencialmente una nueva modalidad de hormonoterapia
Assuntos
Camundongos , Animais , Fator de Crescimento Epidérmico , Camundongos , Transplante de Neoplasias , Neoplasias ExperimentaisRESUMO
Las úlceras cutáneas producidas por las radiaciones ionizantes o por extravasación de citostáticos, son una complicación frecuente en el tratamiento de los pacientes con neoplasias malignas. Estas lesiones son frecuentemente difíciles de tratar e introducen morbilidad adicional y deterioro de la calidad de vida. En este trabajo presentamos las primeras evidencias clínicas del efecto cicatrizante del factor de crecimiento epidérmico en úlceras cutáneas. Se trataron ocho pacientes(dos con úlceras radiógenas, cinco con úlceras por extravasación de citostáticos y uno con úlcera varicosa) mediante aplicación tópica dos veces al día, de una crema de factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10*g/g en crema de sulfadiazina de plata al 1 %). Los dos pacientes con úlcera radiógena de larga evolución cicatrizaron 100 % y 70 % respectivamente. Igualmente, tres pacientes con úlceras por extravasación de epiadriamicina y mostaza nitrogenada tuvieron una respuesta parcial. En otros dos pacientes se pudo detectar precozmente la ulceración por extravasación de vincristina y en estos se logró una re-epitelización completa. La paciente tratada de úlcera varicosa crónica también logró una cicatrización completa en tres meses de tratamiento. Estos resultados constituyen el primer reporte de tratamiento de las úlceras cutáneas en pacientes oncológicos, empleando el factor de crecimiento epidérmico. Esta nueva modalidad puede tener importancia práctica en el tratamiento de tales complicaciones
Assuntos
Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Humanos , Administração Tópica , Fator de Crescimento Epidérmico/uso terapêutico , Úlcera Cutânea/tratamento farmacológicoRESUMO
La radioterapia es una de las modalidades terapéuticas más empleadas en las neoplasias malignas. Una de las complicaciones más frecuentes es la radiodermitis, que obliga frecuentemente a interrumpir el tratamiento. En este trabajo presentamos una evaluación del efecto del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la prevención de la radiodermitis. Se incluyeron 59 pacientes con diagnóstico histològico de carcinoma de piel, los cuales recibieron 2 Gy diarios de roentgenterapia superficial (80 kV) hasta completar 60 Gy. Los pacientes fueron asignados, al azar, a tres grupos: el primer grupo recibió aplicación tópica del EGF (10 *g/g en crema de sulfadiazina de plata al 1 %) en el área irradiada, dos veces al día durante todo el tiempo de tratamiento; el segundo recibió aplicaciones de la crema de sulfadiazina de plata sin EGF y el tercer grupo no recibió tratamiento local. El porcentaje de aparición de radiodermitis fue de 4 %, 41 % y 64 % en los tres grupos, respectivamente. La diferencia en la frecuencia de aparición de radiodermitis entre el grupo tratado con EGF y los restantes fue estadísticamente significativa (p<0,001). Otro grupo de pacientes -en este caso cinco niños que recibieron radioterapia sobre ojo y órbita-, fue tratado con colirio de kanamicina que contenía, además, EGF humano recombinante (10 *g/ml), aplicando 2 gotas cada 4-6 horas durante todo el período de tratamiento. Solamente uno de estos pacientes presentó conjuntivitis radiógena ligera, a una dosis acumulada de radiaciones de 50 Gy, lo cual se compara favorablemente con la experiencia histórica en que la mayoría de estos pacientes padecen conjuntivitis radiógena. Estos resultados constituyen la primera evidencia clínica de efecto radioprotector del EGF humano recombinante, en la piel y en el epitelio ocular, lo cual tiene importancia práctica en el tratamiento radiante de los tumores malignos
Assuntos
Lactente , Pré-Escolar , Criança , Humanos , Conjuntivite/tratamento farmacológico , Fator de Crescimento Epidérmico/uso terapêutico , Lesões por Radiação/tratamento farmacológico , Radiodermite/tratamento farmacológicoRESUMO
El factor de crecimiento epidérmico (EGF), es un polipéptido mitogénico para células de origen epitelial y mesenquimatoso; sin embargo, tiene un efecto inhibitor de la proliferación in vitro de las células que tienen un número muy elevado de receptores de EGF en su superficie. Resultados precedentes de nuestro laboratorio demostraron que este efecto inhibidor también puede obtenerse in vivo, en tumores humanos creciendo como xenotransplantes en ratones atímicos. En este artículo presentamos las primeras evidencias clínicas del efecto del EGF en carcinomas humanos. Se trataron 10 carcinomas de piel (9 pacientes) mediante la aplicación diaria tópica de una crema que contenía 10*g/g de EGF humano recombinante. Durante las tres semanas de tratamiento no se obtuvo ninguna evidencia de progresión tumoral, al contrario, la mitad de las lesiones mostraron una respuesta objetiva favorable. Cuatro pacientes refirieron mejoría subjetiva intensa, dada por alivio del dolor y recuperación funcional de las estructuras afectadas por el tumor. En cuatro pacientes se registraron notables cambios histológicos, dados por una disminución en la proporción de células tumorales en el tejido, un aumento en la reacción estromal y la aparición de infiltrado inflamatorio. La ampliación del concepto de hormono-dependencia, para incluir la regulación de tumores por factores de crecimiento, implica como corolario la aplicación del campo de la terapia hormonal, para incluir el tratamiento con factores de crecimiento o sus análogos. Estos resultados preliminares son la primera evidencia de que estos conceptos pueden ser aplicables en la clínica.
Assuntos
Humanos , Carcinoma/tratamento farmacológico , Fator de Crescimento Epidérmico/uso terapêutico , Neoplasias Cutâneas/tratamento farmacológicoRESUMO
La presencia de receptores para el EGF en los tumores humanos más indiferenciados y el hecho de que el EGF inhibe la proliferación de las células de carcinoma A431 in vitro, nos sugirió la posibilidad de evaluar los efectos del EGF in vivo, en animales portadores de tumores. El tumor ascítico de Ehrlich en ratones fue el modelo escogido. El EGF inyectado en región subcutánea tuvo una rápida distribución, alcanzando el peritoneo y reconociendo los receptores específicos en las células tumorales. Los valores pico se obtuvieron en una hora. La expresión de receptores para el EGF en las células disminuye, durante, al menos, cinco horas. La inyección de EGF inhibió la incorporación de timidina al material ácido-insoluble de las células tumorales. Este efecto fue dependiente de la dosis y se obtuvo tanto con EGF murino como EGF humano. Estos resultados plantean la posibilidad de extender el concepto de dependencia hormonal en los tumores al control de la proliferación por los factores de crecimiento