RESUMO

A raça tropicalmente adaptada Curraleiro Pé Duro (CPD) possui grande rusticidade e capacidade de produção. A técnica de criopreservação de células somáticas permite estocar, por tempo indeterminado, o material genético. O objetivo deste trabalho é avaliar a viabilidade de fibroblastos, pós-criopreservação, em protocolos diferentes. Foi utilizada uma biópsia auricular de um bovino CPD, que passou por antissepsia e anestesia local. Posteriormente o material foi processado e incubado para ser observado quanto à confluência e à morfologia. Em seguida, os fibroblastos foram criopreservados em três tratamentos (T1, T2 e T3). Após serem criopreservados, foram descongelados e analisados quanto à viabilidade celular, à capacidade de crescimento e à morfologia. Na análise de variância e das médias, foram comparados pelo teste de Tukey com significância de 5%. Não foram observadas, nos protocolos, diferenças estatísticas entre a viabilidade celular (T1 = 67,98%, T2 = 71,42% e T3 = 69,93%), a capacidade de confluência (T1 = 80%, T2 = 90%, T3 = 85%) ou a passagem de origem das células. A criopreservação de fibroblastos auriculares de bovinos CPD não mostrou diferença entre os três métodos, sugerindo até que o método que demanda equipamentos menos especializados (T1) é tão eficiente quanto os demais.

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RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a recuperação de espermatozoides epididimários de cães castrados, utilizando as técnicas de fluxo retrógrado (FR) e flutuação (FL) em diluidor Tris-gema, antes e após a criopreservação. Foram coletados 30 complexos testículo-epididímos (CTE), sendo 15 para FR e 15 para FL, e, logo após a recuperação dos espermatozoides, foram analisadas as alterações morfológicas nessas células espermáticas. Após a adição do diluidor, foram avaliados os parâmetros de motilidade total (MOT) e vigor (V) espermáticos. O sêmen pós-criopreservado foi submetido ao teste de termorresistência nos tempos T0, T30, T60 e T90 minutos, além da avaliação das membranas plasmática e acrossomal por sondas fluorescentes. Não houve diferença estatística entre as técnicas quanto à MOT e ao vigor no sêmen diluído (FR-MOT: 82,3% e V: 3,4; FL-MOT: 79,6% e V: 3,2) e pós-criopreservado (FR-MOT: 34% e V: 2,8; FL-MOT: 30% e V: 2,7). A partir do T30, houve diferença significativa quanto à MOT e ao vigor nas técnicas utilizadas, e o tempo também prejudicou o acrossoma espermático a partir do T30. Conclui-se que as técnicas de recuperação de espermatozoides epididimários de cães castrados, testadas neste trabalho, podem ser utilizadas para refrigeração e criopreservação de sêmen.(AU)

The objective of this work was to evaluate the recovery of epididymal spermatozoa from castrated dogs using retrograde flow (FL) and flotation (FL) techniques in Tris-egg yolk diluent, before and after cryopreservation. Thirty testicle-epididymal complexes (CTE) were collected, 15 for FR and 15 for FL and soon after spermatozoid recovery, morphological changes in these spermatic cells were analyzed. After addition of the diluent, the parameters of total motility (MOT) and vigor (V) were evaluated. The post-cryopreserved semen was submitted to thermoresistance (TTR) test at T0, T30, T60 and T90 minutes, as well as the plasma and acrosomal membrane evaluation by fluorescent probes. There was no statistically significant difference between techniques tested for MOT and vigor in the diluted semen (FR-MOT: 82.3% and V: 3.4, FL-MOT: 79.6% and V: 3.2) and post-cryopreserved (FR-MOT: 34% and V: 2.8, FL-MOT: 30% and V: 2.7). From the T30 there was a significant difference regarding MOT and vigor in the used techniques, and the time also damaged the spermatic acrosome from the T30. It is concluded that the epididymal spermatozoa recovering techniques from castrated dogs, tested in this study, can be used for semen refrigeration and cryopreservation.(AU)

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RESUMO

Técnicas de coleta de espermatozoides epididimários são utilizadas em diversas espécies animais, sendo ferramentas de biotecnologias importantes aplicadas em casos de animais que precisam ser castrados ou que vieram a óbito. O objetivo deste trabalho foi avaliar a cinética de espermatozoides criopreservados de cães obtidos por meio de técnicas de recuperação epididimária. Foram coletados 30 complexos testículo-epidídimos (CTE) de cães saudáveis, sendo que cada CTE de determinado animal foi destinado para cada técnica utilizada, 15 direcionados para a técnica de recuperação de espermatozoides epididimários por fluxo retrógrado (FR) e 15 por flutuação (FL). Os CTE foram acondicionados em sacos plásticos identificados, contendo solução salina e levados ao Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal da Universidade Federal do Piauí (LBRA/UFPI) para a realização da diluição e criopreservação espermática após a recuperação epididimária. A congelação foi realizada por meio de uma rampa manual, com as amostras refrigeradas a 5 °C, mantidas em vapor de nitrogênio por 5 minutos e, posteriormente, colocadas no botijão. A análise computadorizada do sêmen (CASA) nas amostras descongeladas foi realizada na Universidade Estadual do Ceará (UECE), sendo avaliados dez parâmetros seminais. Foi empregada a análise de variância, aplicando o teste de Tukey. Nessas amostras, houve diferença significativa quanto à motilidade progressiva entre as técnicas testadas e a motilidade total apresentou valores superiores a 30%, não havendo influência das técnicas nos demais parâmetros seminais. Concluise que a cinética de espermatozoides de cães obtidos por recuperação epididimária avaliados pelo CASA apresentou resultados satisfatórios após a criopreservação.

Epididymal sperm collection techniques are used in several animal species and are important biotechnology tools applied to animals that needed to be castrated or that died. The objective of this study was to evaluate the kinetics of cryopreserved dog sperm obtained by epididymal recovery techniques. Thirty testicular-epididymal complexes (CTE) were collected from healthy dogs, with each CTE of a given animal being assigned to each technique used, 15 of them directed to the retrograde flow epididymal sperm recovery technique and 15 by fluctuation technique. The CTE were placed in identified plastic bags, containing saline solution and taken to the Animal Reproduction Biotechnology Laboratory of the Federal University of Piauí (LBRA/UFPI) for sperm dilution and cryopreservation after epididymal recovery. The freezing was carried out using a manual ramp, with the samples refrigerated at 5 °C, maintained in nitrogen vapor exposition five minutes and, later, placed in the container. Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) was performed in the thawed samples at the State University of Ceará (UECE) and ten seminal parameters were evaluated. Analysis of variance was applied by the Tukey test. In thawed samples, there was a significant difference in progressive motility between the tested techniques and total motility presented values greater than 30%, with no influence of the recovery technique on remaining parameters. It was concluded that the sperm kinetics of dogs obtained by epididymal recovery evaluated by CASA presented satisfactory results after cryopreservation.

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Técnicas de coleta de espermatozoides epididimários são utilizadas em diversas espécies animais, sendo ferramentas de biotecnologias importantes aplicadas em casos de animais que precisam ser castrados ou que vieram a óbito. O objetivo deste trabalho foi avaliar a cinética de espermatozoides criopreservados de cães obtidos por meio de técnicas de recuperação epididimária. Foram coletados 30 complexos testículo-epidídimos (CTE) de cães saudáveis, sendo que cada CTE de determinado animal foi destinado para cada técnica utilizada, 15 direcionados para a técnica de recuperação de espermatozoides epididimários por fluxo retrógrado (FR) e 15 por flutuação (FL). Os CTE foram acondicionados em sacos plásticos identificados, contendo solução salina e levados ao Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal da Universidade Federal do Piauí (LBRA/UFPI) para a realização da diluição e criopreservação espermática após a recuperação epididimária. A congelação foi realizada por meio de uma rampa manual, com as amostras refrigeradas a 5 °C, mantidas em vapor de nitrogênio por 5 minutos e, posteriormente, colocadas no botijão. A análise computadorizada do sêmen (CASA) nas amostras descongeladas foi realizada na Universidade Estadual do Ceará (UECE), sendo avaliados dez parâmetros seminais. Foi empregada a análise de variância, aplicando o teste de Tukey. Nessas amostras, houve diferença significativa quanto à motilidade progressiva entre as técnicas testadas e a motilidade total apresentou valores superiores a 30%, não havendo influência das técnicas nos demais parâmetros seminais. Concluise que a cinética de espermatozoides de cães obtidos por recuperação epididimária avaliados pelo CASA apresentou resultados satisfatórios após a criopreservação.(AU)

Epididymal sperm collection techniques are used in several animal species and are important biotechnology tools applied to animals that needed to be castrated or that died. The objective of this study was to evaluate the kinetics of cryopreserved dog sperm obtained by epididymal recovery techniques. Thirty testicular-epididymal complexes (CTE) were collected from healthy dogs, with each CTE of a given animal being assigned to each technique used, 15 of them directed to the retrograde flow epididymal sperm recovery technique and 15 by fluctuation technique. The CTE were placed in identified plastic bags, containing saline solution and taken to the Animal Reproduction Biotechnology Laboratory of the Federal University of Piauí (LBRA/UFPI) for sperm dilution and cryopreservation after epididymal recovery. The freezing was carried out using a manual ramp, with the samples refrigerated at 5 °C, maintained in nitrogen vapor exposition five minutes and, later, placed in the container. Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) was performed in the thawed samples at the State University of Ceará (UECE) and ten seminal parameters were evaluated. Analysis of variance was applied by the Tukey test. In thawed samples, there was a significant difference in progressive motility between the tested techniques and total motility presented values greater than 30%, with no influence of the recovery technique on remaining parameters. It was concluded that the sperm kinetics of dogs obtained by epididymal recovery evaluated by CASA presented satisfactory results after cryopreservation.(AU)

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Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

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Seminal plasma contains serine proteases and serine protease inhibitor, which are involved in mammalian fertilization, and the inhibitors can be applied to prevent cold-induced sperm capacitation. The effects of different concentrations of two serine protease inhibitors were analyzed, Plasminogen activator inhibitor 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg and 210 ƞg) and Antipain (10µg, 50µg and 100µg) as supplementation to bovine semen cryopreservation extender. The effects of the inhibitors on the sperm parameters (sperm kinetics - CASA, acrosome integrity, plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm defects and acrosome reaction rate) were evaluated in the post-thaw semen. Cryopreservation of sperm with Antipain decreased post-thaw kinetic parameters of MP, VSL, LIN, SRT and the percentage of hyper-activated sperm while PAI-1 (210 ƞg) decreased VSL and LIN. Antipain and PAI-1 had no effect on the integrity parameters of the plasma membrane, mitochondrial membrane potential and sperm defects. Sperm cryopreserved in the presence of Antipain and PAI-1 (70 and 140 ƞg) preserved acrosome integrity, as they were able to complete the in vitro acrosome reaction. In conclusion, the serine protease inhibitors, Antipain and PAI-1 (70 and 140ƞg) are able to preserve the acrosome integrity of cryopreserved bovine sperm.(AU)

A criopreservação é parcialmente prejudicial à fertilidade do sêmen de bovinos e induz mudanças semelhantes à capacitação em espermatozoides. O plasma seminal contém serina-proteases e inibidores de serina-proteases que estão envolvidos na fertilização de mamíferos, e os inibidores podem ser aplicados para evitar uma capacitação espermática induzida pelo frio. Analisaram-se os efeitos de diferentes concentrações de dois inibidores de serina-proteases, inibidor do ativador do plasminogênio 1 - PAI-1 (70ƞg, 140ƞg e 210ƞg) e antipaína (10µg, 50µg e 100µg) na suplementação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. Trinta e seis ejaculados de quatro bovinos Curraleiro Pé-Duro foram usados para criopreservação. Os efeitos dos inibidores sobre os parâmetros dos espermatozoides (cinética espermática - CASA, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, potencial de membrana mitocondrial, defeitos espermáticos e taxa de reação acrossomal) foram avaliados no sêmen pós-descongelamento. A criopreservação de espermatozoides com antipaína diminuiu os parâmetros cinéticos pós-descongelamento de MP, VSL, LIN, SRT e a porcentagem de espermatozoides hiperativados, PAI-1 (210ƞg) diminuiu VSL e LIN. Antipaína e PAI-1 não tiveram efeitos nos parâmetros de integridade da membrana plasmática, no potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos espermáticos. Espermatozoides criopreservados na presença de antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) preservaram a integridade acrossomal, assim como foram capazes de completar a reação acrossômica in vitro. Em conclusão, os inibidores de serina-proteases, antipaína e PAI-1 (70 e 140ƞg) são capazes de preservar a integridade acrossomal de espermatozoides criopreservados de bovinos.(AU)

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O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade in vitro do sêmen criopreservado de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. Foram coletadas amostras de sêmen de 12 cães, sendo seis positivos (GI) e seis negativos (GII) para leishmaniose visceral (LV), semanalmente, totalizando quatro coletas por animal. O sêmen criopreservado foi avaliado pelo teste de termorresistência rápida (TTR), nos tempos zero, 30 e 60 minutos, pela análise computadorizada (CASA) e por meio de sondas fluorescentes; esta última técnica com o intuito de avaliar a integridade das membranas espermáticas. Houve diferença estatística pela técnica de TTR no parâmetro motilidade progressiva, no tempo 0min (68,33% GI e 72,50% GII), e no vigor espermático (2,67 GI e 3,0 GII), no tempo 30min. Quanto ao CASA, houve diferença estatística apenas na motilidade total (27,50% GI e 57,08% GII), embora os demais parâmetros seminais tenham apresentado valores relativos diminuídos nos cães do GI. Nas análises com sondas fluorescentes, foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e ao potencial mitocondrial das células espermáticas. Concluiu-se que a LV pode comprometer a qualidade do sêmen criopreservado de cães parasitados.(AU)

The aim of this study was to evaluate the in vitro quality of cryopreserved semen of dogs naturally infected by Leishmania sp. 12 dog semen samples were collected, with 06 positive (GI) and 06 negative (GII) for Visceral Leishmaniasis (LV), weekly, totaling 04 collections per animal. The cryopreserved semen was evaluated by the Rapid Termorresistência Test (TTR), at 0, 30 and 60 minutes by computer analysis (CASA) and by means of fluorescent probes, the latter technique in order to assess the integrity of the sperm membrane. There was no statistical difference for the TTR technique in the progressive motility parameter, at time 0min (68.33% GI and GII 72.50%), and sperm vigor (2.67 GI and GII 3.0), time 30min. As for the CASA, there was statistical difference only in total motility (27.50% GI and GII 57.08%), although other semen parameters have submitted lower figures for GI dogs. In the analyzes with fluorescent probes statistical differences were noted between the groups in terms of plasma membrane integrity and acrosomal and mitochondrial potential of sperm cells. It was concluded that LV can compromise the quality of cryopreserved semen of infected dogs.(AU)

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O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade in vitro do sêmen criopreservado de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. Foram coletadas amostras de sêmen de 12 cães, sendo seis positivos (GI) e seis negativos (GII) para leishmaniose visceral (LV), semanalmente, totalizando quatro coletas por animal. O sêmen criopreservado foi avaliado pelo teste de termorresistência rápida (TTR), nos tempos zero, 30 e 60 minutos, pela análise computadorizada (CASA) e por meio de sondas fluorescentes; esta última técnica com o intuito de avaliar a integridade das membranas espermáticas. Houve diferença estatística pela técnica de TTR no parâmetro motilidade progressiva, no tempo 0min (68,33% GI e 72,50% GII), e no vigor espermático (2,67 GI e 3,0 GII), no tempo 30min. Quanto ao CASA, houve diferença estatística apenas na motilidade total (27,50% GI e 57,08% GII), embora os demais parâmetros seminais tenham apresentado valores relativos diminuídos nos cães do GI. Nas análises com sondas fluorescentes, foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e ao potencial mitocondrial das células espermáticas. Concluiu-se que a LV pode comprometer a qualidade do sêmen criopreservado de cães parasitados.(AU)

The aim of this study was to evaluate the in vitro quality of cryopreserved semen of dogs naturally infected by Leishmania sp. 12 dog semen samples were collected, with 06 positive (GI) and 06 negative (GII) for Visceral Leishmaniasis (LV), weekly, totaling 04 collections per animal. The cryopreserved semen was evaluated by the Rapid Termorresistência Test (TTR), at 0, 30 and 60 minutes by computer analysis (CASA) and by means of fluorescent probes, the latter technique in order to assess the integrity of the sperm membrane. There was no statistical difference for the TTR technique in the progressive motility parameter, at time 0min (68.33% GI and GII 72.50%), and sperm vigor (2.67 GI and GII 3.0), time 30min. As for the CASA, there was statistical difference only in total motility (27.50% GI and GII 57.08%), although other semen parameters have submitted lower figures for GI dogs. In the analyzes with fluorescent probes statistical differences were noted between the groups in terms of plasma membrane integrity and acrosomal and mitochondrial potential of sperm cells. It was concluded that LV can compromise the quality of cryopreserved semen of infected dogs.(AU)

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RESUMO

A melatonina é o principal hormônio sintetizado e secretado pela glândula pineal e desempenha umafunção importante na regulação dos ciclos reprodutivos sazonais. O seu papel na reprodução concentra-se,sobretudo, em suas ações diretas no ovário. Ela também é conhecida como uma eliminadora de espécie reativade oxigênio (ROS). Dessa forma, o estresse oxidativo é um dos fatores que prejudicam o desenvolvimento tantoin vitro quanto in vivo dos oócitos até a fase de blastocisto. Esta revisão aborda os diversos efeitos da melatoninasobre o desenvolvimento embrionário, assim como os mecanismos responsáveis pela diminuição do estresseoxidativo durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário.

Melatonin is the principal hormone synthesized and secreted by the pineal gland and plays animportant role in the regulation of seasonal breeding cycles. Your role in reproduction is focused on its directactions in the ovary and also be known as a scavenger of reactive oxygen species (ROS). Thus oxidative stress isone of the factors hindering the development in vitro and in vivo oocyte to the blastocyst stage. This reviewcovers the various effects of melatonin on embryonic development, as well as the mechanisms responsible for thereduction of oxidative stress during oocyte maturation and embryo development.

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RESUMO

A melatonina é o principal hormônio sintetizado e secretado pela glândula pineal e desempenha umafunção importante na regulação dos ciclos reprodutivos sazonais. O seu papel na reprodução concentra-se,sobretudo, em suas ações diretas no ovário. Ela também é conhecida como uma eliminadora de espécie reativade oxigênio (ROS). Dessa forma, o estresse oxidativo é um dos fatores que prejudicam o desenvolvimento tantoin vitro quanto in vivo dos oócitos até a fase de blastocisto. Esta revisão aborda os diversos efeitos da melatoninasobre o desenvolvimento embrionário, assim como os mecanismos responsáveis pela diminuição do estresseoxidativo durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário.(AU)

Melatonin is the principal hormone synthesized and secreted by the pineal gland and plays animportant role in the regulation of seasonal breeding cycles. Your role in reproduction is focused on its directactions in the ovary and also be known as a scavenger of reactive oxygen species (ROS). Thus oxidative stress isone of the factors hindering the development in vitro and in vivo oocyte to the blastocyst stage. This reviewcovers the various effects of melatonin on embryonic development, as well as the mechanisms responsible for thereduction of oxidative stress during oocyte maturation and embryo development.(AU)

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