RESUMO

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a known food pathogen, which main reservoir is the intestine of ruminants. The abundance of different STEC lineages in nature reflect a heterogeneity that is characterised by the differential expression of certain genotypic characteristics, which in turn are influenced by the environmental conditions to which the microorganism is exposed. Bacterial homeostasis and stress response are under the control of the alarmone guanosine tetraphosphate (ppGpp), which intrinsic levels varies across the E. coli species. In the present study, 50 STEC isolates from healthy sheep were evaluated regarding their ppGpp content, cytotoxicity and other relevant genetic and phenotypic characteristics. We found that the level of ppGpp and cytotoxicity varied considerably among the examined strains. Isolates that harboured the stx2 gene were the least cytotoxic and presented the highest levels of ppGpp. All stx2 isolates belonged to phylogroup A, while strains that carried stx1 or both stx1 and stx2 genes pertained to phylogroup B1. All but two stx2 isolates belonged to the stx2b subtype. Strains that belonged to phylogroup B1 displayed on average low levels of ppGpp and high cytotoxicity. Overall, there was a negative correlation between cytotoxicity and ppGpp.

Assuntos

RESUMO

Objetivos: A habilidade de colonizar as células da mucosa intestinal é uma característica importante quando avaliamos o perfil de virulência das STECs. A adesão pela intimina foi considerada por muitos anos o único fator importante de colonização pelas STEC. Entretanto o rápido progresso das análises genômicas tem acelerado a descoberta de outras formas importantes de adesão, que tem emergido como importantes fatores de colaboração para a colonização intestinal. Material e Método: O nível de adesão de 15 cepas stx+, isoladas de ovinos, foi avaliado por teste de adesão em células Hep-2. As células foram incubadas por 24-48 horas em placas contendo meio DMEM e 10% de soro fetal bovino e em seguida foi adicionado meio DMEM e 2% de soro fetal bovino contendo 1% de D-manose. Uma população de 5x107 células foi inoculada em cada poço. As placas foram incubadas a 37 C por 3 horas. As células foram então lisadas e incubadas por 5 minutos. A contagem do número de colônia viáveis foi utilizado como parâmetro para medição do nível de adesão. Resultados: O nível de adesão entre os grupos stx1, stx2 e stx1+stx2 foi de maneira geral homogêneo e menor do que o da cepa controle O157:H7 stx+. Cabe lembrar que os isolados eram eae negativos, e esta é, provavelmente, a característica genotípica responsável pela menor adesão. Entretanto, já foram relatadas STEC LEE-negativas associadas à doença

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Objetivos: O alarmônio ppGpp acumula-se em bactérias submetidas a estresses nutricionais, tais como a limitação de aminoácidos, carbono ou fosfato e também em bactérias submetidas a estresses ambientais. O acúmulo de ppGpp provoca a resposta severa, caracterizada por uma radical diminuição na síntese de ribossomos e proteínas, impedindo o crescimento bacteriano. A capacidade dos agentes patogénicos causadores de doenças alimentares sobreviver em certos alimentos depende de seus mecanismos de resposta ao estresse, neste sentido foi objetivo deste estudo avaliar a variabilidade da produção de ppGpp em isolados STEC de diferentes perfis stx+. Material e Método: Foi avaliada a produção de ppGpp em 33 cepas STEC. As bactérias foram cultivadas em meio mínimo, após este prazo, alíquotas foram retiradas e misturadas a volumes iguais de 2 M de ácido fórmico. O extrato celular foi aplicado a placas de cromatografia. O extrato foi resolvido colocando as placas em uma câmara de cromatografia contendo 1.5 M KH2PO4 (pH 3.4) como solvente e analisada em um Phosphor-Imager. A quantidade de ppGpp foi estimada através da medição de radioatividade dos spots. Resultados: Em média, as cepas stx1 apresentaram um nível de ppGpp de 0,25 unidades, as stx1+stx2 0,28 unidades e as stx2 0,36 unidades. Ou seja, as STEC que carregam apenas stx2 apresentaram em média pelo menos 30% a mais de ppGpp que as c

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Objetivos: A contagem de PFU/mL indica a eficiência de produção de fagos pela indução dos prófagos, e geralmente corresponde à eficiência de expressão de genes localizados no lócus stx, bem como a expressão dos promotores stx1 e stx2 nos fagos-stx é diferentemente regulada. Em geral fagos lisogênicos tem particular importância para a dinâmica populacional das células hospedeiras como as STEC. Eles podem aumentar a aptidão competitiva da bactéria hospedeira devido a sua capacidade de alternar para o ciclo lítico e destruir bactérias rivais. Material e Método: Os isolados STEC (n=67) foram cultivados e após uma alíquota foi coletada e centrifugada, em seguida foi adicionado 50µl de clorofórmio. Foram feitas diluições seriadas do sobrenadante e plaqueadas com Top agar e a bactéria receptora E. coli C600. A contagem das unidades formadoras de placas de lise (PFU) foi realizada após a incubação há 37C por 24 horas. Os testes de resistência aos antimicrobianos foram realizados usando-se a técnica de disco-difusão. Resultados: Foram observadas as seguintes frequências de resistência (sulfametoxazol + trimetoprim 1.49%; ciprofloxacina 0%; cefalotina 40.29%; cefoxitina 0%; tetraciclina 0%; ertapenem 1.49%; amicacina 2.98%; gentamicina 1.49%; amoxicilina+clavulanato 0%; norfloxacin 0% e ampicilina 0%). Nota-se também que a disseminação da resistência a cefalotina independe da produçã

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Objetivos: Os genes stx1 e stx2 estão localizados em prófagos do tipo lambda, e nessa condição sua expressão é reprimida. Uma efetiva produção de toxina shiga ocorre somente no momento da indução do prófago e seu posterior desenvolvimento lítico, incluindo a replicação do genoma do fago como um elemento extracromossomal. Material e Método: O potencial de produção da toxina shiga foi observada indiretamente através da indução e quantificação dos fagos stx em 70 isolados (filogrupos B1 e A), com relação ao perfil stx (stx1, stx2, stx1+stx2) foram analisadas 72 cepas. Os isolados foram cultivados com ciprofloxacina durante 18hs. Após este período uma alíquota da cultura foi coletada e centrifugada (10.000rpm/2min), em seguida foi adicionado 50µl de clorofórmio. Depois foram feitas diluições seriadas do sobrenadante e plaqueadas juntamente com Top agar e a bactéria receptora E. coli C600. A contagem das unidades formadoras de placas de lise (PFU) foi realizada após a incubação há 37C por 24 horas. Resultados: Das 60 cepas pertencentes ao filogrupo B1 53% apresentaram placas de lise (32/60), enquanto que somente 20% (2/10) das cepas do filogrupo A expressaram seus prófagos. Já quando comparamos o perfil stx+ a expressão dos profágos, observamos que os isolados do perfil Stx1 foram os que mais expressaram, 72%; enquanto que no perfil stx2 somente dois isolados apresentaram placas d

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Objetivos: RpoS contribui para a virulência através do esforço de sobrevivência contra os sistemas de defesa do hospedeiro, ou diretamente através da regulação de fatores de virulência em certos patógenos. A capacidade dos agentes patogênicos causadores de doenças alimentares sobreviver em certos alimentos depende, principalmente, de seus mecanismos de resposta ao estresse. Neste sentido foi objetivo deste estudo avaliar a variabilidade da produção de RpoS em isolados STEC de diferentes perfis stx+. Material e Métodos: Foi avaliada a produção de RpoS em 31 cepas, 8 cepas stx2, 16 cepas stx1+stx2 e 7 cepas stx1. O lisado de células foi resolvido em gel de acrilamida, e após a eletroforese, as proteínas foram transferidas a uma membrana de nitrocelulose submetida a ensaio de imuno-detecção com o soro anti-RpoS e soro anti-IgG conjugado. Para detecção do complexo, foi utilizado kit de detecção e a membrana exposta a filmes de raios-X. Resultados: Não observamos diferenças significativas no nível de produção de RpoS entre os perfis stx1 e stx2. O perfil stx1+ stx2 produziu, em geral, níveis menores de RpoS do que os dois perfis anteriores, mas nenhuma era rpoS-negativa. Avaliar o nível de produção de RpoS nos isolados STEC é fundamental pois já foi demonstrada sua importância para a E. coli O157:H7 sobreviver sob alta pressão hidrostática, em solo adubado com esterco, em á

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Objetivos: Os genes stx1 e stx2 estão localizados em prófagos do tipo lambda, e nessa condição sua expressão é reprimida. Uma efetiva produção de toxina shiga ocorre somente no momento da indução do prófago e seu posterior desenvolvimento lítico, incluindo a replicação do genoma do fago como um elemento extracromossomal. Material e Método: O potencial de produção da toxina shiga foi observada indiretamente através da indução e quantificação dos fagos stx em 70 isolados (filogrupos B1 e A), com relação ao perfil stx (stx1, stx2, stx1+stx2) foram analisadas 72 cepas. Os isolados foram cultivados com ciprofloxacina durante 18hs. Após este período uma alíquota da cultura foi coletada e centrifugada (10.000rpm/2min), em seguida foi adicionado 50µl de clorofórmio. Depois foram feitas diluições seriadas do sobrenadante e plaqueadas juntamente com Top agar e a bactéria receptora E. coli C600. A contagem das unidades formadoras de placas de lise (PFU) foi realizada após a incubação há 37C por 24 horas. Resultados: Das 60 cepas pertencentes ao filogrupo B1 53% apresentaram placas de lise (32/60), enquanto que somente 20% (2/10) das cepas do filogrupo A expressaram seus prófagos. Já quando comparamos o perfil stx+ a expressão dos profágos, observamos que os isolados do perfil Stx1 foram os que mais expressaram, 72%; enquanto que no perfil stx2 somente dois isolados apresentaram placas d

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Objetivos: A contagem de PFU/mL indica a eficiência de produção de fagos pela indução dos prófagos, e geralmente corresponde à eficiência de expressão de genes localizados no lócus stx, bem como a expressão dos promotores stx1 e stx2 nos fagos-stx é diferentemente regulada. Em geral fagos lisogênicos tem particular importância para a dinâmica populacional das células hospedeiras como as STEC. Eles podem aumentar a aptidão competitiva da bactéria hospedeira devido a sua capacidade de alternar para o ciclo lítico e destruir bactérias rivais. Material e Método: Os isolados STEC (n=67) foram cultivados e após uma alíquota foi coletada e centrifugada, em seguida foi adicionado 50µl de clorofórmio. Foram feitas diluições seriadas do sobrenadante e plaqueadas com Top agar e a bactéria receptora E. coli C600. A contagem das unidades formadoras de placas de lise (PFU) foi realizada após a incubação há 37C por 24 horas. Os testes de resistência aos antimicrobianos foram realizados usando-se a técnica de disco-difusão. Resultados: Foram observadas as seguintes frequências de resistência (sulfametoxazol + trimetoprim 1.49%; ciprofloxacina 0%; cefalotina 40.29%; cefoxitina 0%; tetraciclina 0%; ertapenem 1.49%; amicacina 2.98%; gentamicina 1.49%; amoxicilina+clavulanato 0%; norfloxacin 0% e ampicilina 0%). Nota-se também que a disseminação da resistência a cefalotina independe da produçã

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Objetivos: O alarmônio ppGpp acumula-se em bactérias submetidas a estresses nutricionais, tais como a limitação de aminoácidos, carbono ou fosfato e também em bactérias submetidas a estresses ambientais. O acúmulo de ppGpp provoca a resposta severa, caracterizada por uma radical diminuição na síntese de ribossomos e proteínas, impedindo o crescimento bacteriano. A capacidade dos agentes patogénicos causadores de doenças alimentares sobreviver em certos alimentos depende de seus mecanismos de resposta ao estresse, neste sentido foi objetivo deste estudo avaliar a variabilidade da produção de ppGpp em isolados STEC de diferentes perfis stx+. Material e Método: Foi avaliada a produção de ppGpp em 33 cepas STEC. As bactérias foram cultivadas em meio mínimo, após este prazo, alíquotas foram retiradas e misturadas a volumes iguais de 2 M de ácido fórmico. O extrato celular foi aplicado a placas de cromatografia. O extrato foi resolvido colocando as placas em uma câmara de cromatografia contendo 1.5 M KH2PO4 (pH 3.4) como solvente e analisada em um Phosphor-Imager. A quantidade de ppGpp foi estimada através da medição de radioatividade dos spots. Resultados: Em média, as cepas stx1 apresentaram um nível de ppGpp de 0,25 unidades, as stx1+stx2 0,28 unidades e as stx2 0,36 unidades. Ou seja, as STEC que carregam apenas stx2 apresentaram em média pelo menos 30% a mais de ppGpp que as c

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Objetivos: A habilidade de colonizar as células da mucosa intestinal é uma característica importante quando avaliamos o perfil de virulência das STECs. A adesão pela intimina foi considerada por muitos anos o único fator importante de colonização pelas STEC. Entretanto o rápido progresso das análises genômicas tem acelerado a descoberta de outras formas importantes de adesão, que tem emergido como importantes fatores de colaboração para a colonização intestinal. Material e Método: O nível de adesão de 15 cepas stx+, isoladas de ovinos, foi avaliado por teste de adesão em células Hep-2. As células foram incubadas por 24-48 horas em placas contendo meio DMEM e 10% de soro fetal bovino e em seguida foi adicionado meio DMEM e 2% de soro fetal bovino contendo 1% de D-manose. Uma população de 5x107 células foi inoculada em cada poço. As placas foram incubadas a 37 C por 3 horas. As células foram então lisadas e incubadas por 5 minutos. A contagem do número de colônia viáveis foi utilizado como parâmetro para medição do nível de adesão. Resultados: O nível de adesão entre os grupos stx1, stx2 e stx1+stx2 foi de maneira geral homogêneo e menor do que o da cepa controle O157:H7 stx+. Cabe lembrar que os isolados eram eae negativos, e esta é, provavelmente, a característica genotípica responsável pela menor adesão. Entretanto, já foram relatadas STEC LEE-negativas associadas à doença