RESUMO

Anaplasma marginale (A. marginale) is a worldwide pathogen that infects a variety of ruminants, but mostly cattle. The present study aimed to describe an isolation technique for A. marginale, using chicken embryo Þ broblast (CEF) cell culture. Blood and tick samples were collected from 5 calves from 2 to 3 months old, which were considered to be infected with A.marginale due to anemia, jaundiced mucous membranes, and prostration. DNA extraction and PCR were performed for diagnosis using blood and tick samples. All tick and blood samples tested positive in PCR. Additionally, ticks were crushed with the aid of a blender for inoculation in CEF cell culture. After inoculation, the cultures were kept at 37ºC and 5% CO2 for 15 days. The cell supernatant of cell cultures was again analyzed using PCR and Wright stain method to conÞ rm A. marginale isolation. Cell cultures tested positive in PCR, and the presence of the agent was demonstrated by Wright stain. Therefore, by using CEF cell culture it was possible to isolate and amplify the A. marginale in a concentration of 1.3 x 107.2 bodies per mL. The CEF cells are undemanding and easy to preserve; they are an option for isolation and production of A. marginale under laboratory conditions.(AU)

Anaplasma marginale (A. marginale) é um patógeno mundial que infecta uma variedade de ruminantes, mas principalmente bovinos. O presente estudo teve como objetivo descrever uma técnica de isolamento para A. marginale, utilizando cultivo celular de Þ broblastos de embriões (CFE) de galinhas. Para isso, foram coletadas amostras de sangue e de carrapatos de 5 bezerros, entre 2 e 3 meses de idade, os quais, devido a anemia, icterícia de mucosas e prostração, foram considerados supostamente infectados com A. marginale. Ethics Approval This study was approved by Credenciamento Institucional para Atividades com Animais em Ensino ou Pesquisa (CIAEP: 02.0420.2021). Consent to participate Not applicable Consent to publish Not applicable Data availability Not applicable Para o diagnóstico, realizaram-se extração de DNA e posterior PCR a partir das amostras de sangue e de carrapatos coletados. Todos os carrapatos e amostras de sangue foram positivas para o teste de PCR. Além disso, os carrapatos foram triturados com o auxílio de um liquidiÞ cador para inoculação em CFE. Após a inoculação, as culturas foram mantidas a 37ºC e a 5% de CO2 durante 15 dias. O sobrenadante celular das culturas foi novamente analisado por PCR e pela técnica de coloração de Wright para conÞ rmar o isolamento de Anaplasma marginale. As culturas celulares foram po sitivas por PCR, e a presença do agente foi comprovada por meio da coloração de Wright. Portanto, utilizando CFE, foi possível isolar e ampliÞ car o A. marginale em uma concentração de 1,3x107,2 bactérias por ml. As células da CEF são pouco exigentes, de fácil manutenção e uma boa opção para isolamento e produção de A. marginale em condição laboratorial.(AU)

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Anaplasmataceae includes the genera Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia and Wolbachia, comprising a group of obligate intracellular bacteria. The genus Anaplasma has pathogenic species transmitted by ticks of veterinary and human health importance. Wild ungulates such as deer represent important reservoirs and amplifiers of Anaplasmataceae. The interaction between deer and domestic ruminants represents a serious problem due to the transmission of these pathogens through their ectoparasites. In the present study, we investigated the presence of Anaplasmataceae organisms in blood, tissues and tick samples of a gray-brocket deer (Mazama gouazoubira). The specimen was found dead in a farm in northeast Uruguay. PCRs targeting partial regions of 16S rRNA and groESL genes were carried out for Anaplasmataceae DNA detection. Moreover, several ectoparasites were identified: the chewing louse Tricholipeurus albimarginatus, the Neotropical deer louse fly Lipoptena mazamae, and the ticks Haemaphysalis juxtakochi and Rhipicephalus microplus. A consensus sequence of 1274 bp of 16S rRNA was generated for Anaplasma sp. from the M. gouazoubira blood sample. All ticks analysed by PCR assays were negative. No band was detected in any of the samples after PCR targeting groESL gene. Phylogenetic analysis using 16S rRNA partial gene sequences, clustered the putative novel genotype sequence obtained in this study, named Anaplasma sp. genotype Mazama-Uruguay, along with Anaplasma sp. detected in Mazama sp., Mazama americana and Mazama bororo, all deer species from Brazil. Furthermore, this cluster showed to be closely related to Anaplasma bovis sequences obtained from various ruminants and other mammals from several parts of the world. The pathogenicity as well as its infecting potential to other cervids or domestic ruminants is currently unknown. Further studies should be performed in order to characterize this novel species, especially targeting other genes.

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Las especies más frecuentes de hemoparásitos en ovinos y caprinos son el Anaplasma ovis, la Babesia ovis y el Trypanosoma vivax. Entre febrero y junio de 2011 se realizó un estudio descriptivo transversal en seis apriscos de cinco municipios del norte y nororiente de Antioquia para determinar la infección por hemoparásitos en caprinos y ovinos. Un total de 95 animales de diferentes razas y edades fueron evaluados. Se emplearon dos métodos de diagnóstico directo parasitológico, por observación en extendido de sangre periférica coloreados con la técnica Hemacolor y por la técnica de Woo modificada. Se observó una frecuencia de infección por Anaplasma sp del 73,7%. No se hallaron parásitos de los géneros Babesia sp. y Trypanosoma sp. Aunque se observó alta frecuencia de infección por Anaplasma sp., no se observaron animales sintomáticos y el nivel de parasitemia fue inferior al 1%. Los animales menores de nueve meses de edad presentaron 69,2% de infección. Adicionalmente, se estableció una asociación entre infección por Anaplasma sp. y estado fisiológico de los animales, observándose que el 64,3% de la población positiva a este hemoparásito correspondió a hembras gestantes y lactantes. Los niveles más bajos de infección se encontraron en apriscos donde los animales eran tratados con triclorfon, producto utilizado para el control de ectoparásitos. Se concluye que existe alta frecuencia de Anaplasma sp. infectando ovinos y caprinos de los apriscos estudiados.

Anaplasma ovis, Babesia ovis, and Trypanosoma vivax are the most frequent species of blood parasites in sheep and goats. A cross sectional study was conducted in six farms from five municipalities in the north and northeast of Antioquia between February through June 2011 to determine infection by blood parasites in goats and sheep. A total of 95 animals of different breeds and ages were evaluated. We used two direct parasitological methods to evaluate blood smears stained with Hemacolor and the modified Woo technique. The infection by Anaplasma sp. was 73.7%. No parasites of Babesia sp. and Trypanosoma sp. genus were detected. high infection frequency by Anaplasma sp. was detected, symptomatic animals were not observed and parasitemia levels were less than 1%. Infection levels of animals less than nine months of age reached 69.2%. An association between infection with Anaplasma sp. and the physiological status of the animals was also established, with 64.3% of the population positive to this hemoparasite corresponding to pregnant and lactating females. The lowest infection levels were found in farms where animals were treated with trichlorfon, a product used for ectoparasite control. We conclude there is a high frequency of Anaplasma sp. infecting sheep and goats in the studied farms.

Em ovinos e caprinos as espécies mais frequentes de hemoparasitas são: Anaplasma ovis, a Babesia ovis e o Trypanosoma vivax. Realizou-se um estudo descritivo transversal entre os meses de fevereiro e junho de 2011 em seis granjas com o objetivo de determinar a infecção por hemoparasitas em caprinos e ovinos de cinco municípios do norte e nordeste de Antioquia. Avaliaram-se 95 animais de diferentes raças e idades. Empregaram-se dois métodos de diagnostico direto parasitológico; por observação em estendido de sangue periférica corados com a técnica Hemacolor e pela técnica de Woo modificada. A frequência encontrada de infecção por Anaplasma sp foi de 73.7%. Não se encontraram parasitas dos gêneros Babesia sp e Trypanosoma sp. Ainda que se encontrou uma alta frequência de infecção por Anaplasma sp, não se observaram animais sintomáticos e as porcentagens de parasitemia foram inferiores ao 1%. Os animais menores de nove meses apresentaram uma porcentagem de infecção de 69.2%. Adicionalmente, estabeleceu-se a associação entre a infecção por Anaplasma sp e o estado fisiológico dos animais, onde o 64.3% da população positiva para esta hemoparasita correspondeu a fêmeas gestantes e lactantes. Os menores valores de infecção encontraram-se em granjas onde os animais foram tratados com triclorfon, produto utilizado para o controle de ectoparasitas. Concluiu-se que o Anaplasma sp se encontra numa alta frequência infetando ovinos e caprinos das granjas estudadas nos municípios do norte e nordeste de Antioquia.