RESUMO

Abstract A cryopreservation protocol was developed for in vitro shoot tips of Garcinia hombroniana using the vitrification technique. Four critical steps in the technique were investigated, namely preculture, loading, dehydration with Plant Vitrification Solution 2 (PVS2), and unloading. Shoot tips precultured for 48 h gave significantly higher survival (75 %) compared to 24 h preculture (50 %) after cryopreservation. Treatment with 1 M glycerol plus 0.4 M sucrose as a loading solution gave higher survival (45.83 %) compared to the other treatments (0.4 M sucrose + 2 M glycerol; 0.4 M sucrose). Shoot tips dehydrated with PVS2 for 25 min gave the highest survival after immersion in liquid nitrogen. Stepwise PVS2 treatment for 15 min with 50 % PVS2 followed by 10 min with 100 % PVS2 solution improved survival of the shoot tips after cryopreservation (41.67 %). Murashige and Skoog medium with 0.4 M sucrose gave significantly higher survival (66.67 %) than MS with 1.2 M sucrose (25 %) as an unloading solution. Water content was shown to decrease throughout the whole vitrification steps from 6.83 ± 1.66 g g-1 dw for fresh shoot tips down to 2.93 ± 0.28 g g-1 dw after PVS2 treatment. Further study on each step including recovery medium is required to improve the survival. Nevertheless, the present study showed the potential of using the vitrification technique for cryopreservation of G. hombroniana. Rev. Biol. Trop. 66(3): 1314-1323. Epub 2018 September 01.

Resumen Se desarrolló un protocolo de crioconservación in vitro para ápices caulinares de Garcinia hombroniana mediante la técnica de vitrificación, con cuatro etapas críticas: precultivo, carga de crioprotector, deshidratación con solución de vitrificación vegetal 2 (PVS2), y descarga. Ápices precultivados por 48 h sobrevivieron más (75 %) que los de 24 h (50 %) después de la crioconservación. El tratamiento con glicerol 1 M más sacarosa 0.4 M como solución de carga permitió mayor sobrevivencia (45.83 %) que los otros tratamientos (sacarosa 0.4 M + glicerol 2 M; sacarosa 0.4 M). Los ápices deshidratados con PVS2 por 25 min registraron la mayor sobrevivencia tras inmersión en nitrógeno líquido. El tratamiento gradual por 15 min con solución de PVS2 al 50 %, seguido por 10 min al 100 %, mejoró la sobrevivencia de ápices tras la crioconservación (41.67 %). El medio Murashige-Skoog (MS) con sacarosa 0.4 M produjo una sobrevivencia significativamente mayor (66.67 %) que MS con sacarosa 1.2 M (25 %) como solución de descarga. El contenido de agua disminuyó a lo largo del proceso de vitrificación desde 6.83 ± 1.66 g g-1 peso seco, en ápices frescos, hasta 2.93 ± 0.28 g g-1 peso seco después del tratamiento con PVS2. Se requiere de más investigación sobre cada etapa, incluyendo el medio de recuperación, para mejorar la tasa de sobrevivencia. Sin embargo, este estudio muestra el potencial de la vitrificación para la crioconservación de G. hombroniana.

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The objective of this study is to test stem apex sizes in the in vitro establishing of Angelonia integerrima in order to obtain explants without by fungi and bacteria contamination for further multiplications. The treatments consisted of different stem apex sizes (1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 and 11.0 mm). At 45 and 90 days of cultivation, a count of contaminated explants and a count of shoots per explant formed were performed. In a second experiment, explants were cultivated in a medium containing different concentrations of benzylaminopurine (BAP) (0.0, 0.05, 0.10, 0.15 and 0.20 mg L-1). After 56 days of cultivation, the following variables were evaluated: shoot length, shoot fresh mass and number of shoots. During the explant establishment phase (45 days), only stem apexes with 1.0 mm in size were not contaminated. However, in the second subculture (at 90 days), only shoots from initial explants, with 7 mm in size or larger, were contaminated. Regarding multiplication, the presence of BAP showed a positive linear behavior for all variables. It is possible to obtain A. integerrima seedlings free of contamination in vitro by fungi and bacteria, using initial explants less than or equal to 5 mm. IBA provided a linear increment for the multiplication of this species.

O objetivo do trabalho foi testar tamanhos de ápices caulinares no estabelecimento in vitro de Angelonia integerrima, a fim de obter explantes sem contaminações por fungos e bactérias para posterior multiplicação. Os tratamentos consistiram de tamanhos de ápices caulinares: 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 9,0 e 11,0 mm. Após 45 e 90 dias de cultivo foi realizada a contagem de explantes contaminados e o número de brotos formados por explante. Em um segundo experimento, explantes foram cultivados em meio contendo diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP): 0,0; 0,05; 0,10; 0,15 e 0,20 mg L-1. Após 56 dias de cultivo foram avaliados: comprimento e massa fresca da parte aérea e número de brotos. Durante a fase de estabelecimento (45 dias), somente explantes com 1,0 mm não apresentaram contaminação, já no segundo subcultivo (aos 90 dias) somente brotações oriundas de explantes com tamanho inicial igual ou superior a 7 mm apresentaram contaminação. Com relação à multiplicação, a presença de BAP apresentou comportamento linear positivo para todas as variáveis analisadas. É possível obter mudas de A. integerrima livres de contaminações in vitro por fungos e bactérias, utilizando explantes iniciais menores ou iguais a 5 mm. O BAP proporcionou incremento linear para a multiplicação da espécie.

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The experiment had the objective of developing a protocol for the in vitro establishment of Jacaratia spinosa in different concentrations of 6-benzylamino purine (6-BA). The explants were, caulinars apexes of plants proceeding from the field, disinfested with solution of Saniagri® 33% v/v, during 15 minutes and later sprayed with a solution of sodium hypochlorite 1% v/v. The Murashige and Skoog medium was used with the concentration of sucrose reduced for 5g L-1. The 6-BA concentrations had been: (T1) 0,0 mg L-1, (T2) 0,5 mg L-1, (T3) 1,0 mg L-1, (T4) 1,5 mg L-1, (T5) 2,0 mg L-1. The experiment was installed in a completely randomized design, with 10 apexes per treatment. The visual evaluations of the frequencies of survival of the apexes and number of lateral shoots, had weekly been made, per 90 days, and the results in percentage were submitted to the regression analysis and test of the Quisquare. The decontamination percentage varied between 60% and 80%. The frequencies of survival of the apexes had varied from 41.7% up to 58.3%, however with no statistical differences among the treatments. It was not observed the emission of lateral shoots in the used treatments, during the 90 days, but new studies are necessary with other concentrations of phytoregulators.

Com o objetivo de desenvolver um protocolo para o estabelecimento in vitro de Jacaratia spinosa a partir de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (6-BA), foram utilizados como explantes, ápices caulinares de plantas provenientes do campo, desinfestados com solução de Saniagri® 33% v/v, durante 15 minutos e posteriormente pulverizados com uma solução de hipoclorito de sódio 1% v/v. O meio utilizado foi o Murashige e Skoog com a concentração de sacarose reduzida para 5g L-1. As concentrações de 6-BA foram: 0,0 mg L-1, 0,5 mg L-1, 1,0 mg L-1, 1,5 mg L-1, 2,0 mg L-1. O delineamento experimental usado foi o inteiramente casualizado, com 10 ápices por concentração de 6-BA. As avaliações visuais das freqüências de sobrevivência dos ápices e número de brotações laterais foram feitas semanalmente, por 90 dias, sendo os resultados em porcentagem submetidos à análise regressão e ao teste do Quiquadrado para várias proporções a 1% de significância. A porcentagem de descontaminação variou entre 60% e 80%. A curva de regressão sugere que a concentração zero apresentou sobrevivência superior às demais, porém o teste do Qui-quadrado mostra que as freqüências variaram de 41,7% até 58,3%, não havendo diferença estatística entre as concentrações de 6-BA. Não foi observada durante os 90 dias, a emissão de brotações laterais nos explantes, sendo necessários novos estudos com outras concen

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The experiment had the objective of developing a protocol for the in vitro establishment of Jacaratia spinosa in different concentrations of 6-benzylamino purine (6-BA). The explants were, caulinars apexes of plants proceeding from the field, disinfested with solution of Saniagri® 33% v/v, during 15 minutes and later sprayed with a solution of sodium hypochlorite 1% v/v. The Murashige and Skoog medium was used with the concentration of sucrose reduced for 5g L-1. The 6-BA concentrations had been: (T1) 0,0 mg L-1, (T2) 0,5 mg L-1, (T3) 1,0 mg L-1, (T4) 1,5 mg L-1, (T5) 2,0 mg L-1. The experiment was installed in a completely randomized design, with 10 apexes per treatment. The visual evaluations of the frequencies of survival of the apexes and number of lateral shoots, had weekly been made, per 90 days, and the results in percentage were submitted to the regression analysis and test of the Quisquare. The decontamination percentage varied between 60% and 80%. The frequencies of survival of the apexes had varied from 41.7% up to 58.3%, however with no statistical differences among the treatments. It was not observed the emission of lateral shoots in the used treatments, during the 90 days, but new studies are necessary with other concentrations of phytoregulators.

Com o objetivo de desenvolver um protocolo para o estabelecimento in vitro de Jacaratia spinosa a partir de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (6-BA), foram utilizados como explantes, ápices caulinares de plantas provenientes do campo, desinfestados com solução de Saniagri® 33% v/v, durante 15 minutos e posteriormente pulverizados com uma solução de hipoclorito de sódio 1% v/v. O meio utilizado foi o Murashige e Skoog com a concentração de sacarose reduzida para 5g L-1. As concentrações de 6-BA foram: 0,0 mg L-1, 0,5 mg L-1, 1,0 mg L-1, 1,5 mg L-1, 2,0 mg L-1. O delineamento experimental usado foi o inteiramente casualizado, com 10 ápices por concentração de 6-BA. As avaliações visuais das freqüências de sobrevivência dos ápices e número de brotações laterais foram feitas semanalmente, por 90 dias, sendo os resultados em porcentagem submetidos à análise regressão e ao teste do Quiquadrado para várias proporções a 1% de significância. A porcentagem de descontaminação variou entre 60% e 80%. A curva de regressão sugere que a concentração zero apresentou sobrevivência superior às demais, porém o teste do Qui-quadrado mostra que as freqüências variaram de 41,7% até 58,3%, não havendo diferença estatística entre as concentrações de 6-BA. Não foi observada durante os 90 dias, a emissão de brotações laterais nos explantes, sendo necessários novos estudos com outras concen

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The object of this study was to find a nutricional means for the cultivation of the shoot tips of Perola pineapples, in order to free them of infections caused by Fusarium subglutinas. The first step was to remove healthy shoot tips from healthy crowns under aseptic conditions and inoculate nine different cultivation media with or whithout traces of BAP, GA3 and AIA. The levels of necrosis in the plants were studied after 30,45 and 60 days. Selected shoot tips removed from the plants contaminated with F. subglutinans were inoculated to check their viability as pathogen-free clones. The results revealed the influence of the cultivation media in the regeneration of plants and the viability of clonal cleansing of infected plants. It was also noted that 100% of the regenerated plants remained pathogen-free.

O presente trabalho teve como objetivo adequar um meio nutritivo ao cultivo de ápices caulinares de abacaxizeiro, cv. Pérola, visando a limpeza clonal de plantas infectadas por Fusarium subglutinans, agente causal da fusariose. Inicialmente, ápices de mudas sadias, tipo coroa, foram retirados sob condições assépticas e inoculados em 9 composições de meios de cultivo, com presença e ausência de BAP, GA3 e AIA. Aos 30, 45 e 60 dias após a inoculação, observou-se o grau de necrose dos explantes. Nos meios selecionados inocularam- se ápices caulinares retirados de mudas contaminadas por F. subglutinans, a fim de verificar a viabilidade da limpeza clonal. Os resultados mostraram que houve influência do meio de cultivo na regeneração de plantas e a viabilidade da limpeza clonal de mudas infectadas, também foi constatada uma vez que 100% das plantas regeneradas estavam livres do patógeno.

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The object of this study was to find a nutricional means for the cultivation of the shoot tips of Perola pineapples, in order to free them of infections caused by Fusarium subglutinas. The first step was to remove healthy shoot tips from healthy crowns under aseptic conditions and inoculate nine different cultivation media with or whithout traces of BAP, GA3 and AIA. The levels of necrosis in the plants were studied after 30,45 and 60 days. Selected shoot tips removed from the plants contaminated with F. subglutinans were inoculated to check their viability as pathogen-free clones. The results revealed the influence of the cultivation media in the regeneration of plants and the viability of clonal cleansing of infected plants. It was also noted that 100% of the regenerated plants remained pathogen-free.

O presente trabalho teve como objetivo adequar um meio nutritivo ao cultivo de ápices caulinares de abacaxizeiro, cv. Pérola, visando a limpeza clonal de plantas infectadas por Fusarium subglutinans, agente causal da fusariose. Inicialmente, ápices de mudas sadias, tipo coroa, foram retirados sob condições assépticas e inoculados em 9 composições de meios de cultivo, com presença e ausência de BAP, GA3 e AIA. Aos 30, 45 e 60 dias após a inoculação, observou-se o grau de necrose dos explantes. Nos meios selecionados inocularam- se ápices caulinares retirados de mudas contaminadas por F. subglutinans, a fim de verificar a viabilidade da limpeza clonal. Os resultados mostraram que houve influência do meio de cultivo na regeneração de plantas e a viabilidade da limpeza clonal de mudas infectadas, também foi constatada uma vez que 100% das plantas regeneradas estavam livres do patógeno.