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Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.(AU)

A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.(AU)

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Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.(AU)

A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.(AU)

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ABSTRACT Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.

RESUMO A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.

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Staphylococci isolated from bovine milk and not classified as Staphylococcus aureus represent a heterogeneous group of microorganisms that are frequently associated with bovine mastitis. The identification of these microorganisms is important, although it is difficult and relatively costly. Genotypic methods add precision in the identification of Staphylococcus species. In the present study, partial 16S rRNA sequencing was used for the species identification of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci isolated from bovine mastitis. Two hundred and two (95%) of the 213 isolates were successfully identified at the species level. The assigning of an isolate to a particular species was based on ≥99% identity with 16S rRNA sequences deposited in GenBank. The identified isolates belonged to 13 different Staphylococcus species; Staphylococcus chromogenes, S. aureus and Staphylococcus epidermidis were the most frequently identified species. Eight isolates could not be assigned to a single species, as the obtained sequences showed 99% or 100% similarity to sequences from two or three different Staphylococcus species. The relatedness of these isolates with the other isolates and reference strains was visualized using a cladogram. In conclusion, 16S rRNA sequencing was an objective and accurate method for the proper identification of Staphylococcus species isolated from bovine mastitis. Additional target genes could be used in non-conclusive cases for the species-level identification of these microorganisms.

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Evaluation of a simplified key for the identification of coagulase-positiveStaphylococcus isolated from bovine mastitis. Three hundred fourty four strains of coagulasepositiveStaphylococcus (CPS), isolated from mastitis cases, underwent phenotypic and genotypictests to evaluate the efficiency of a simplified key, based on phenotypic tests for thediscrimination of these microorganisms. The tests consisted of amplification of the femA geneand hemolysis in blood agar, production of acetoin and fermentation of maltose, mannitol andtrehalose. Strains that showed negative results in the amplification test of the femA gene or thatwere not identified as Staphylococcus aureus (S. aureus) by phenotypic tests were tested with theAPISTAPH kit (Biomériux-France), for precise identification of species. Phenotypic testsrevealed 338 strains (98.25%) as S. aureus, three strains (0.86%) as Staphylococcus hyicus, and threemicroorganisms (0.86%) as Staphylococcus intermedius. PCR demonstrated that 338 (98.25%)strains belonged to the S. aureus species, confirming the results for 336 strains from 338identified, through a simplified phenotypic key. A high rate of correlation (98.83%) was verifeidbetween the results of genotypic and phenotypic tests for the identification of S. aureus,demonstrating the applicability of the proposed key, for the discrimination of this microorganismin CPS isolated from bovine mastitis.(AU)

Visando testar a eficiência de uma chavesimplificada baseada em testes fenotípicos para a discriminação de Staphylocococcus coagulasepositivos (SCP) isolados de infecções intramamárias de bovinos, 344 amostras destesmicrorganismos foram submetidas a testes fenotípicos e genotípicos. Estes consistiram naamplificação do gene femA, na observação de hemólise em ágar sangue, produção de acetoína efermentação de maltose, manitol e trealose. Amostras que apresentaram resultado negativo naamplificação do gene femA ou que foram identificadas com não Staphylococcus aureus (S. aureus) pormeio dos testes fenotípicos foram submetidas ao kit APISTAPH (Biomériux-França) paraidentificação mais precisa. Os testes fenotípicos utilizados na chave simplificada permitiramidentificar 338 amostras (98,25%) como S. aureus, três amostras (0,86%) como Staphylococcus hyicuse três (0,86%) como Staphylococcus intermedius. Por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR)338 (98,25%) amostras foram identificadas como S. aureus, ratificando os resultados para 336 das338 amostras identificadas por meio da chave fenotípica simplificada. Observou-se elevadaconcordância (98,83%) entre os resultados dos testes genotípicos e fenotípicos para a identificaçãode S. aureus, demonstrando a aplicabilidade da chave de identificação proposta para adiscriminação deste microrganismo entre SCP isolados de casos de mastite bovina.(AU)

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Evaluation of a simplified key for the identification of coagulase-positive Staphylococcus isolated from bovine mastitis. Three hundred fourty four strains of coagulase-positive Staphylococcus (CPS), isolated from mastitis cases, underwent phenotypic and genotypic tests to evaluate the efficiency of a simplified key, based on phenotypic tests for the discrimination of these microorganisms. The tests consisted of amplification of the femA gene and hemolysis in blood agar, production of acetoin and fermentation of maltose, mannitol and trehalose. Strains that showed negative results in the amplification test of the femA gene or that were not identified as Staphylococcus aureus (S. aureus) by phenotypic tests were tested with the APISTAPH kit (Biomériux-France), for precise identification of species. Phenotypic tests revealed 338 strains (98.25%) as S. aureus, three strains (0.86%) as Staphylococcus hyicus, and three microorganisms (0.86%) as Staphylococcus intermedius. PCR demonstrated that 338 (98.25%) strains belonged to the S. aureus species, confirming the results for 336 strains from 338 identified, through a simplified phenotypic key. A high rate of correlation (98.83%) was verifeid between the results of genotypic and phenotypic tests for the identification of S. aureus, demonstrating the applicability of the proposed key, for the discrimination of this microorganism in CPS isolated from bovine mastitis.

Visando testar a eficiência de uma chave simplificada baseada em testes fenotípicos para a discriminação de Staphylocococcus coagulase positivos (SCP) isolados de infecções intramamárias de bovinos, 344 amostras destes microrganismos foram submetidas a testes fenotípicos e genotípicos. Estes consistiram na amplificação do gene femA, na observação de hemólise em ágar sangue, produção de acetoína e fermentação de maltose, manitol e trealose. Amostras que apresentaram resultado negativo na amplificação do gene femA ou que foram identificadas com não Staphylococcus aureus (S. aureus) por meio dos testes fenotípicos foram submetidas ao kit APISTAPH (Biomériux-França) para identificação mais precisa. Os testes fenotípicos utilizados na chave simplificada permitiram identificar 338 amostras (98,25%) como S. aureus, três amostras (0,86%) como Staphylococcus hyicus e três (0,86%) como Staphylococcus intermedius. Por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) 338 (98,25%) amostras foram identificadas como S. aureus, ratificando os resultados para 336 das 338 amostras identificadas por meio da chave fenotípica simplificada. Observou-se elevada concordância (98,83%) entre os resultados dos testes genotípicos e fenotípicos para a identificação de S. aureus, demonstrando a aplicabilidade da chave de identificação proposta para a discriminação deste microrganismo entre SCP isolados de casos de mastite bovina.

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La diferenciación rápida del tipo de estafilococo hallado en los hemocultivos permite establecer tempranamente un tratamiento apropiado y evita el inicio de antibióticos de tipo glicopéptido. Objetivo: determinar el rendimiento de la prueba de la coagulasa, hecha directamente con el contenido de los viales de hemocultivos, en los cuales se detectaba crecimiento de cocos grampositivos compatibles con estafilococos. Métodos: en caso de observar en el vial de hemocultivo solo cocos grampositivos compatibles con estafilococos, se procedía a hacer la prueba directa de la coagulasa, interpretándola cuatro horas después. Se hacían subcultivo e identificación de la bacteria y se comparaba el resultado con el de la prueba directa. Resultados: se hicieron 1.518 pruebas de coagulasa directa de las que 411 (27,1%) fueron positivas y 1.107 (72,9%), negativas. Se cultivaron 446 cepas de S. aureus de las que 410 tuvieron la prueba de coagulasa directa positiva, para una sensibilidad del 91,9%. Solo en un vial de los 411 con la prueba positiva se aisló un Staphylococcus spp., coagulasa negativa, lo cual determinó una especificidad del 99,8%. El valor predictivo positivo fue 99,7% y el negativo, 96,7%. Conclusiones: los resultados confirman la utilidad de la prueba de la coagulasa directa en los viales de hemocultivos para diferenciar oportunamente el tipo de estafilococo cultivado. Se puede emplear como una prueba presuntiva para decidir el inicio o no del tratamiento empírico del paciente infectado por cocos grampositivos, al obtener el reporte preliminar de los hemocultivos.

Rapid differentiation of Staphylococcus spp. strains grown in bood cultures is the basis for early and appropriate treatment of S. aureus infections. Objective: To evaluate the usefulness of the direct tube coagulase test done from blood culture vials with presumptive growth of Staphylococci. Methods: Direct tube coagulase test was carried out if only clusters of gram-positive cocci were observed in the blood culture vials; interpretation was done four hours later and results were compared with those obtained with colonies from subcultures. Results: 1.518 direct tube coagulase tests were carried out; of them, 411 (27.1%) were positive and 1.107 (72.9%), negative. Out of the 446 strains of S. aureus that were isolated, 410 had positive direct tube coagulase test (sensitivity 91.9%). An additional strain of S. aureus was positive in the direct test but negative in the subculture (specificity 99.9%). Predictive values were 99.7% (positive) and 96.7% (negative). Conclusions: Our results confirm the usefulness of the direct tube coagulase test done from blood cultures to opportunely differentiate staphylococci grown in blood cultures. Information so obtained may be used to decide the beginning of empirical treatment.

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Staphylococci are frequently related to food poisoning outbreaks that are caused by their enterotoxins. The enterotoxins production is highly correlated to coagulase production, which one is detected in identification of pathogenic strains. Usually the coagulase test is conducted using lyophilized rabbit plasma, or even fresh rabbit blood, separated by sedimentation. The lyophilized plasma has high costs and the fresh material is obtained in small volumes from the animals, what made it unpractical. The objective of this work was evaluating the utilization of an alternative material to rabbit plasma, in this case the horse plasma, in coagulase test for staphylococci isolated from raw milk. So, 410 typical and atypical staphylococci colonies were tested for coagulase production using both plasmas. The results showed 284 (69.26%) positives for coagulase production and 126 (30.73%) negatives, with 100% of concordance between both plasmas. These results indicate the viability in using horse plasma in coagulase test for staphylococci isolated from raw milk, and complementary studies are necessary with strains from different types of food.

Estafilococos têm grande importância na indústria de alimentos por serem associados a surtos de intoxicação alimentar, pela ação de suas enterotoxinas. A produção dessas substâncias tem alta correlação com a produção da enzima coagulase, que é detectada na identificação de cepas potencialmente patogênicas. Esse teste é tradicionalmente realizado com plasma de coelho liofilizado ou pela sua separação de sangue coletado de coelhos. O plasma liofilizado tem alto custo e a punção cardíaca, além de ser bastante cruenta, permite a obtenção apenas de pequenos volumes de material. Este trabalho tem como objetivo verificar a viabilidade da utilização de um material alternativo ao plasma de coelho, neste caso o plasma de cavalo, no teste de coagulase para estafilococos isolados de leite cru. Assim, 410 colônias típicas e atípicas de estafilococos isoladas de leite cru foram submetidas ao teste de coagulase utilizandose os dois plasmas. Os resultados identificaram 284 (69,26%) colônias coagulase positivas e 126 (30,73%) coagulase negativas, com concordância de 100% entre os dois plasmas. Os resultados obtidos indicam que a utilização do plasma de cavalo pode ser uma alternativa viável na pesquisa de estafilococos coagulase positivos em leite cru.