RESUMO

Snakebites are an important Public Health issue, so much so that they are classified as Neglected Tropical Diseases (NTDs) in category A, by the World Health Organization (WHO). The biggest victims are young people, mainly rural workers, who often, due to temporary or even permanent disability, end up affecting not only their family, but their entire community. Annually in Brazil, 90% of reported cases are caused by the Bothrops genus. Bothrops jararacussu is probably one of the most fearsome and imposing of this genus. Its bite is painful, and the main local effect is myonecrosis, which can result in deficient muscle regeneration. Its venom is mainly composed of phospholipases A2, which is why it has an important myotoxic effect. These phospholipases are myotoxic components that directly destabilize the plasma membrane of muscle cells, causing the influx of calcium ions and so hypercontraction and the early appearance of cells with delta lesions. Understanding the pathogenesis of poisoning is of fundamental importance for studies of better therapies.

O ofidismo é uma questão importante de Saúde Pública, tanto que está classificado como Doenças Tropicais Negligenciadas (DTN) na categoria A, pela Organização Mundial da Saúde (OMS). As maiores vítimas são jovens, principalmente trabalhadores rurais, que muitas vezes pela incapacidade temporária ou até permanente, acabam afetando não só sua família, mas toda a sua comunidade. Anualmente no Brasil, 90% dos casos notificados são causados pelo gênero Bothrops. A Bothrops jararacussu é provavelmente uma das mais temíveis e imponentes deste gênero. Sua picada é dolorosa e como principal efeito local temos a mionecrose, que pode ter como sequela uma regeneração muscular deficiente. Seu veneno é composto principalmente por fosfolipases A2, o motivo de ter um efeito miotóxico importante. Essas fosfolipases são componentes miotóxicos que desestabilizam diretamente a membrana plasmática das células musculares, causando o influxo de íons cálcio e consequentemente uma hipercontração e o aparecimento precoce de células com lesões delta. A compreensão da patogênese dos envenenamentos é de fundamental importância para estudos de melhores terapias.

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Bacterial resistance is a sanitary issue explained by indiscriminate use of nonprescription drugs, and antimicrobial use in food production for growth promotion. Bothropstoxin-I (BthTx-I) is a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops jararacussu venom, which has a known antimicrobial effect. The goal of this study was the unprecedented evaluation of in vivo antimicrobial activity of BthTx-I in broilers. Microbiological, biochemical, and histological parameters were determined using 84 21-day old broilers that were kept in cages with four birds each at a density of 625 cm2/broiler. The experiment was randomized by three treatments with seven repetitions of four broilers each that lasted seven days. The treatments were: 1) bacitracin zinc diet; 2) PLA2-BthTx-I; 3) without additives. The data obtained from the studied variables was subjected to analysis of variance and an F-test at the 5% significance level. Averages of each variable in each treatment were compared by Tukey’s test. Broiler bacterial cloacal counts showed that BthTx-I decreased the microbial population without reducing body weight, intestinal morphology, or liver or kidney histopathological damage. The toxin showed in vivo activity, being an alternative for better performance in the production of broiler chickens, because it acted by decreasing the microbial load of potentially pathogenic bacteria in the intestinal

A resistência bacteriana é uma questão sanitária, explicada pelo uso indiscriminado de medicamentos sem receita médica e pelo uso de antimicrobianos na produção de alimentos para promover o crescimento. Bothropstoxin-I (BthTx-I) é uma fosfolipase A2 (PLA2) obtida do veneno da Bothrops jararacussu. A PLA2 do veneno de cobra tem efeito antimicrobiano conhecido. Objetivou-se com este estudo avaliar sem precedentes a atividade antimicrobiana in vivo de BthTx-I em frangos de corte. Os parâmetros microbiológicos, bioquímicos e histológicos foram realizados em 84 frangos de corte com 21 dias de idade mantidos em gaiolas com quatro animais cada e densidade de 625 cm2/frango. O experimento foi dividido em três tratamentos com sete repetições de quatro frangos cada um, com duração de sete dias. Os tratamentos foram: 1) dieta com bacitracina de zinco; 2) PLA2-BthTx-I; 3) sem aditivos. Os dados obtidos das variáveis estudadas foram submetidos à análise de variância e teste F ao nível de significância de 5%. As médias dos tratamentos em cada variável foram comparadas pelo teste de Tukey. A contagem cloacal bacteriana de frangos de corte mostrou que o BthTx-I diminuiu a população microbiana sem comprometer o peso corporal, a morfologia intestinal ou causar danos histopatológico no fígado e rins. Concluiu-se que a toxina apresentou atividade in vivo, sendo uma alternativa para um melhor desempenho na produção de frangos de corte, pois agiu diminuindo a carga microbiana de bactérias potencialmente patogênicas na microbiota intestinal das aves e não causou danos musculares, hepáticos ou renais na dosagem avaliada.

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Bacterial resistance is a sanitary issue explained by indiscriminate use of nonprescription drugs, and antimicrobial use in food production for growth promotion. Bothropstoxin-I (BthTx-I) is a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops jararacussu venom, which has a known antimicrobial effect. The goal of this study was the unprecedented evaluation of in vivo antimicrobial activity of BthTx-I in broilers. Microbiological, biochemical, and histological parameters were determined using 84 21-day old broilers that were kept in cages with four birds each at a density of 625 cm2/broiler. The experiment was randomized by three treatments with seven repetitions of four broilers each that lasted seven days. The treatments were: 1) bacitracin zinc diet; 2) PLA2-BthTx-I; 3) without additives. The data obtained from the studied variables was subjected to analysis of variance and an F-test at the 5% significance level. Averages of each variable in each treatment were compared by Tukey’s test. Broiler bacterial cloacal counts showed that BthTx-I decreased the microbial population without reducing body weight, intestinal morphology, or liver or kidney histopathological damage. The toxin showed in vivo activity, being an alternative for better performance in the production of broiler chickens, because it acted by decreasing the microbial load of potentially pathogenic bacteria in the intestinal(AU)

A resistência bacteriana é uma questão sanitária, explicada pelo uso indiscriminado de medicamentos sem receita médica e pelo uso de antimicrobianos na produção de alimentos para promover o crescimento. Bothropstoxin-I (BthTx-I) é uma fosfolipase A2 (PLA2) obtida do veneno da Bothrops jararacussu. A PLA2 do veneno de cobra tem efeito antimicrobiano conhecido. Objetivou-se com este estudo avaliar sem precedentes a atividade antimicrobiana in vivo de BthTx-I em frangos de corte. Os parâmetros microbiológicos, bioquímicos e histológicos foram realizados em 84 frangos de corte com 21 dias de idade mantidos em gaiolas com quatro animais cada e densidade de 625 cm2/frango. O experimento foi dividido em três tratamentos com sete repetições de quatro frangos cada um, com duração de sete dias. Os tratamentos foram: 1) dieta com bacitracina de zinco; 2) PLA2-BthTx-I; 3) sem aditivos. Os dados obtidos das variáveis estudadas foram submetidos à análise de variância e teste F ao nível de significância de 5%. As médias dos tratamentos em cada variável foram comparadas pelo teste de Tukey. A contagem cloacal bacteriana de frangos de corte mostrou que o BthTx-I diminuiu a população microbiana sem comprometer o peso corporal, a morfologia intestinal ou causar danos histopatológico no fígado e rins. Concluiu-se que a toxina apresentou atividade in vivo, sendo uma alternativa para um melhor desempenho na produção de frangos de corte, pois agiu diminuindo a carga microbiana de bactérias potencialmente patogênicas na microbiota intestinal das aves e não causou danos musculares, hepáticos ou renais na dosagem avaliada.(AU)

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ABSTRACT Idiopathic membranous nephropathy (IMN) is a frequent cause of nephrotic syndrome in adults. In terms of etiology, the condition may be categorized as primary/idiopathic or secondary. Literature on the pathophysiology of IMN has indicated the presence of autoantibodies (PLA2R and THSD7A) directed against podocyte antigens. The detection of antibodies against a domain favors IMN. The presence of autoantibodies against one of the domains would in theory exclude the possibility of there being autoantibodies against the other domain. However, cases of patients with PLA2R- and THSD7A-positive disease have been recently reported, showing that antibodies against two targets may be concomitantly produced via yet unknown pathophysiological mechanisms. This study reports the case of a 46-year-old male patient with nephrotic-range proteinuria, hematuria, hypoalbuminemia, and hypercholesterolemia submitted to biopsy and histopathology examination (LM, IF, IHC, and EM) eventually diagnosed with PLA2R- and THSD7A-positive IMN associated with IgA nephropathy, stressing our experience with the use of IgG subclasses, PLA2R, and THSD7A in the workup for MN and the relevance of adopting a broad and adequate approach to elucidating and acquiring knowledge of the pathophysiology of IMN.

RESUMO A Nefropatia Membranosa Idiopática (NMi) é uma frequente causa de síndrome nefrótica em adultos e sua etiologia pode ser estratificada em primária/idiopática ou secundária. O conhecimento da fisiopatologia da NMi sugeriu a presença de autoanticorpos (PLA2R e a THSD7A) direcionados contra antígenos existentes nos podócitos. A detecção de anticorpos contra um domínio favorece NMi. A presença de autoanticorpos contra um desses domínios autoexcluiria a possibilidade de autoanticorpos contra o outro domínio; no entanto, recentemente foram descritos casos que apresentaram dupla positividade para PLA2R e THSD7A, comprovando que, por mecanismos fisiopatológicos ainda não conhecidos, raramente pode existir produção concomitante de anticorpos contra os dois alvos. O presente estudo tem por objetivo relatar o caso de um paciente de 46 anos de idade, do sexo masculino, que apresentou quadro de proteinúria nefrótica, hematúria, hipoalbuminemia e hipercolesterolemia submetido a biópsia e exame histopatológico (ML, IF, IHQ e ME), confirmando um caso raro de NMi com positividade dupla para os anticorpos anti-PLA2R e anti-THSD7A e associação à nefropatia por IgA, mostrando nossa experiência com a utilização de subclasses de IgG, PLA2R e THSD7A na rotina laboratorial para a investigação da GNM e enfatizando a importância de uma abordagem ampla para adequada elucidação e conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos na NMi.

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Toxins that exhibit phospholipase A2 (PLA2) activity are present in snake venoms from Elapidae and Viperidae families. They are neurotoxic and act by impairing synaptic transmission from the neuromuscular junction. Although the principal target of these toxins is the neuromuscular junction, there are several studies that have used neuronal cells from central structures in order to characterize their mechanism of action and this model has proved to be very useful. In relation to glial cells, however, there are few studies showing some effect of PLA2 from animal venoms. Glial cells, astrocytes in particular, have important roles in the central and peripheral nervous system, being part of the synapses. The objective of this study was to characterize the action of the PLA2 toxin, β-micrustoxin, isolated from Micrurus lemniscatus snake venom, on cultured astrocytes, addressing cell viability, cell proliferation, cell cycle phases distribution, protein expression of p53, p27 and p21, cell senescence and mitochondrial membrane potential. Gene and protein expression of the phospholipase A2 receptor (PLA2R) was evaluated, as well as the internalization process in cultured astrocytes and hippocampal neurons. The partial toxin primary sequence was also characterized by proteolytic digestion and by comparison of the peptides acquired with data bases. Astrocytes and neurons were obtained from Wistar rats (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) and maintained in culture in DMEM medium + 10% SFB or Neurobasal medium + B27, respectively, at 37°C, 5% CO2. Astrocytes were incubated with β–micrustoxin for several times. Cell viability was evaluated by MTT test; cell proliferation, cell cycle phases and p53, p21 and p27 proteins were evaluated by flow cytometry. Cell senescence was analyzed by β-galactosidase assay and mitochondrial potential was also analyzed by using the TMRE probe. In order to investigate the internalization process, β-micrustoxin was conjugated to Alexa 488 fluorophore and the cells observed in confocal microscopy, in normal medium and with the PLA2 activity inhibited. β-micrustoxin reduced cell viability and cell proliferation of astrocytes. The G2/M phase was augmented and does not was verified DNA fragmentation nor mitochondrial potential alteration. β-micrustoxin induced increase in the cell cycle regulatory proteins, p53, p21 and p27. β-micrustoxin conjugated with Alexa 488 internalized in astrocytes and neurons. This process is dependent on PLA2 activity in neurons, but not in astrocytes. PLA2R is expressed very acutely in astrocytes but it is also expressed in hippocampal neurons, even though in minor quantities. The data allowed to conclude that β-micrustoxin interferes in astrocytes cell proliferation, by inducing a cell cycle arrest in G2/M phase and this effect is mediated by p53, p21 and p27, without evidence of cell death. Moreover, there are evidences that β-micrustoxin would induce its effects throughout its internalization in the cell cytosol. This study contributes to a better understanding of the cell events involved in the toxicity induced by the PLA2 β-micrustoxin, isolated from the venom of the snake Micrurus lemniscatus. Besides, it opens a perspective of developing new drugs that could have inhibitory actions on cell proliferation.

Toxinas com atividade de fosfolipase A2 (FLA2) são encontradas em venenos de serpentes das famílias Elapidae e Viperidae e são caracterizadas por sua atividade neurotóxica, ocasionando o bloqueio da junção neuromuscular. Apesar de o alvo dessas toxinas ser a junção neuromuscular, vários estudos utilizaram células neuronais centrais para caracterizar seus mecanismos de ação e estas se mostraram um bom modelo. Pouco se conhece, no entanto, sobre as atividades desempenhadas por essas enzimas em células da glia, como os astrócitos, sendo que este tipo celular desempenha funções importantes tanto no sistema nervoso central quanto periférico. O objetivo deste estudo foi caracterizar as ações da toxina FLA2 β-micrustoxina, isolada do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, em astrócitos em cultura, quanto à viabilidade celular, proliferação celular, distribuição das fases do ciclo celular, expressão de proteínas regulatórias p53, p27 e p21, senescência celular e potencial da membrana mitocondrial. Ainda, avaliou-se a expressão proteica e gênica do receptor para FLA2 (FLA2R) e a ocorrência do processo de internalização da toxina em astrócitos e neurônios hipocampais em cultura. A sequência primária parcial da toxina foi identificada pela obtenção de fragmentos peptídicos por digestão proteolítica e comparação com base de dados. Astrócitos e neurônios hipocampais de ratos Wistar (CEUAIB – Protocolo n°1223/14) foram mantidos em cultura em meio DMEM + 10% SFB e meio Neurobasal + B27, respectivamente, a 37°C, 5% CO2. Os astrócitos foram tratados com a β–micrustoxina por diferentes períodos de tempo. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT e a proliferação celular, as fases do ciclo celular e as proteínas p53, p21 e p27 foram avaliadas por citometria de fluxo. A senescência celular foi avaliada pelo ensaio de β- galactosidase e o potencial da membrana mitocondrial foram avaliados utilizando a sonda TMRE. Para a análise da internalização celular, a β-micrustoxina foi conjugada ao fluoróforo Alexa 488 e observado o processo de internalização em microscópio confocal, em condições normais ou com a inibição da atividade FLA2. A β-micrustoxina reduziu a viabilidade e a proliferação celular de astrócitos e houve um predomínio da fase G2/M. Não houve fragmentação do DNA nem alteração do potencial mitocondrial. A β-micrustoxina induziu o aumento das proteínas regulatórias do ciclo celular p53, p21 e p27. Observou-se a internalização da β-micrustoxina tanto em astrócitos como em neurônios. Esse processo é dependente da atividade FLA2 em neurônios, mas não em astrócitos. O FLA2R está expresso em astrócitos com muita intensidade, mas também em neurônios hipocampais. Os dados obtidos permitem concluir que a β-micrustoxina interfere na proliferação celular de astrócitos, induzindo a parada do ciclo celular na fase G2/M, mediada pelas proteínas p53, p21 e p27, sem evidências de indução de morte celular. Além disso, os dados evidenciam que a β-micrustoxina pode induzir os seus efeitos através de sua internalização na célula. Este estudo contribui para o melhor entendimento dos eventos celulares que levam à toxicidade induzida pela FLA2 β-micrustoxina isolada do veneno da serpente Micrurus leminiscatus e abre perspectivas de desenvolvimento de novos fármacos com ações inibitórias sobre a proliferação celular.

RESUMO

RESUMO Este estudo pretendeu verificar as melhores condições operacionais para a hidrólise de lipídeos presentes em efluente de frigorífico de suínos, comparando uma fosfolipase comercial livre e uma imobilizada, assim como o potencial para reutilização da fosfolipase imobilizada nas reações de hidrólise e sua manutenção de capacidade lipolítica em condições de armazenamento. Analisaram-se a influência da temperatura, o pH e a concentração da fosfolipase na hidrólise, obtendo-se como valores ótimos 36ºC, 8,5 e 1,1% (m.v-1), respectivamente. Os valores de ácidos graxos livres obtidos para a enzima livre e imobilizada diferiram significativamente (p<0,05), sendo os valores para a enzima imobilizada superiores, com máximo de 34 µmol.mL-1. Foram realizados 18 ciclos de reúso da fosfolipase imobilizada nas reações de hidrólise, e até o 17º reúso a atividade relativa ficou acima de 50%. A enzima imobilizada estocada em temperatura de refrigeração manteve a mesma liberação de ácidos graxos até o sétimo dia de armazenamento.

ABSTRACT This study intended to determine the best operating conditions for the hydrolysis of lipids present in wastewater of slaughterhouse swine comparing a free commercial phospholipase and an immobilized one, as well as the potential for reuse of the immobilized phospholipase in hydrolysis reactions and the maintenance of its lipolytic capacity in storage conditions. The influence of temperature, pH and concentration of phospholipase hydrolysis were analyzed, yielding optimal values such as 36ºC, 8.5 and 1.1% (w.v-1), respectively. The amounts of free fatty acids obtained for free and immobilized enzyme differed significantly (p<0.05); the values were higher for the immobilized enzyme, with a maximum of 34 µmol.mL-1. There were performed 18 cycles of reuse in immobilized phospholipase hydrolysis reactions, and until the 17th reuse the relative activity was above 50%. The immobilized enzyme stored at refrigeration temperature remained the same fatty acids release until the 7th day of storage.

RESUMO

O sistema de secreção tipo IV (T4SS) da família de bactérias Xanthomonadaceae transfere efetores (X-Tfes) com a capacidade de matar outras bactérias, conferindo uma vantagem em comunidades bacterianas mistas para colonizar diferentes nichos como o solo ou as superfícies das plantas. Os X-Tfes possuem diferentes domínios putativos com atividades hidrolíticas contra componentes do envelope celular bacteriano do tipo: glicohidrolases, transglicosilases, amidases e lipases. Os X-Tfes por sua atividade biológica inata podem ocasionar dano intracelular para a bactéria que os produz. Para se proteger contra estas atividades, também são produzidas lipoproteínas com função inibitoria (X-Tfis) localizadas no periplasma. Os genes que codificam os X-Tfes e os X-Tfis estão organizados em operons, o que permite gerar os pares efetor/inibidor simultaneamente. Entre os potenciais X-Tfes do fitopatógeno Xanthomonas citri estão Xac1918 e Xac0574. Xac1918 é uma proteína com um domínio da superfamília da lisozima e um domínio conhecido como RTX (Repeats in Toxin) de ligação ao cálcio, enquanto Xac0574 tem um domínio da superfamília da lipase 3. Os seus possíveis inibidores, Xac1917 e Xac0573 respectivamente, apresentam um peptídeo sinal no N-terminal contendo o lipobox representativo das lipoproteínas. As proteínas Xac0574 e Xac0573 são monômeros em solução que formam um complexo estável 1:1, favorecido termodinamicamente (ΔG°= -12 Kcal/mol) com uma constante de dissociação de 2,45 nM, garantindo que a bactéria fique protegida contra os efeitos nocivos de Xac0574 quando é produzida intracelularmente. Xac0574 é uma fosfolipase A1, sem atividade lisofosfolipase, com a capacidade de hidrolisar os três fosfolipídios majoritários que compõem a membrana celular bacteriana, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina e fosfatidiletanolamina (PE), mostrando uma aparente preferência pelo último. A atividade enzimática de Xac0574 explica a forte inibição do crescimento celular em E. coli após da sua indução heteróloga, já que gera uma diminuição de quase 10 vezes da população celular comparada com a cultura não induzida com a mesma construção. Poroutro lado, Xac0573 inibe efetivamente a atividade enzimática de Xac0574 ao formar o complexo, além de não ter atividade fosfolipase nem lisofosfolipase. Foram produzidos cristais da Xac1918 e Xac0573 que difrataram com uma resolução de 3,0 e 2,5 Å, respectivamente. Porém, só foi gerado um modelo de Xac0573. Xac0573 está composta por duas folhas ß antiparalelas com uma topologia característica de ß sanduíche Com uma pequena hélice e duas voltas. Um alinhamento de homólogos de Xac0573 identificou nas extremidades da proteína as regiões conservadas, constituindo duas possíveis interfaces de interação que podem ser as responsáveis por bloquear o acesso dos fosfolipídios ao sítio catalítico ou impedir os rearranjos estruturais de Xac0574 que são necessários para a sua atividade enzimática. Adicionalmente, a topologia da Xac0573 é semelhante do domínio C2, conhecido em eucariotos como domínio de ligação ao lipídio e ao cálcio, e está envolvido em processos de sinalização de segundos mensageiros lipídicos, proteínas de trafego de membranas e mecanismos de fusão de membranas. Nossos resultados apontam para uma nova função biológica do domínio C2 como um inibidor enzimático intracelular em bactérias

The type IV secretion system (T4SS) of the bacteria family Xanthomonadaceae transfers effectors (X-Tfes) with that can kill other bacterial cells, conferring an advantage to the bacterial community during colonization of different niches in the soil or on the plant surface. The X-Tfes possess different putative domains with hydrolytic activity against components of the bacterial cellular envelope, including glycohydrolase, transglycolase, amidase and lipase domain. The innate biological activity of X-Tfes can cause intracellular damage. Therefore, the bacteria that produce them also produce lipoproteins with inhibitor function (X-Tfis) located in the periplasm for their protection. The genes that code for X-Tfes and X-Tfis are organized in operons that allow for their simultaneous expression. Among the X-Tfes of the phytopathogen Xanthomonas citri are Xac1918 and Xac0574. Xac1918 is carries a lysozyme superfamily domain, as well as a domain known as RTX (Repeats in Toxic) predict to bind calcium, while, Xac0574 has a domain belonging to the lipase 3 superfamily. Their possible inhibitors, Xac1917 e Xac0573 respectively, carry an N-terminal signal peptide containing a lipobox found in bacterial lipoproteins. The Xac0574 and Xac0573 proteins are both monomers in solution, They can form a stable 1:1 complex, that is thermodynamically favored (ΔG°= -12 Kcal/mol) with a dissociation constant of 2,45 nM. This affinity ensure that the bacterium is protected against the harmful effects of Xac0574 when it is produced intracellularly. We show that Xac0574 is a phospholipase A1, without lisophospholipase activity, and is able to hydrolyze the three most common phospholipids found in the membranes of Gram negative bacteria, namely phosphatidylglycerol (PG), cardiolipin and phosphatidylethanolamine (PE), presenting an apparent preference for PE. The enzymatic activity of Xac0574 explains the strong inhibition of growth of E. coli cells after its heterologous induction: a nearly 10-fold decrease in the cell population is observed when compared to the non-induced culture with the same construct. On the other hand, Xac0573 effectively inhibits the enzymatic activity of Xac0574. Furthermore, Xac0573 does not possess when forming the complex, besides not having phospholipase nor lysophospholipase activity.Crystals of Xac1918 and Xac0573 were produced which diffracted with to resolution of 3.0 and 2.5 Å, respectively. However, we were able to resolve the structure of only Xac0573. Xac0573 is composed of two anti-parallel sheet that form a ß-sandwich with three small helices. An alignment to Xac0573 homologs identified conserved regions at the ends of the protein that constitute two possible interfaces of interaction that may be responsible for blocking the access of the phospholipids to the catalytic site or impede the structural rearrangements of Xac0574 that are necessary for its enzymatic activity. Additionally, the topology of Xac0573 is similar to that to C2 domains, known in eukaryotes to bind lipids and calcium and to be involved in signaling processes mediated by lipid second messengers, membrane trafficking and membrane fusion mechanisms. Our results point to a new biological function of the C2 domain as an intracellular enzyme inhibitor in bacteria

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Jellyfishes are amongst the most familiar of venomous marine animals. Jellyfish encounters with humans are common, although subsequent envenomation has varying toxicity ranging from usually mild symptoms to sometimes lethal consequences. Jellyfish venoms are of biotechnological importance, with toxins displaying antimicrobial, analgesic and anti-tumor activities. Furthermore, proteolytic enzymes have also been described. Recently, the proteomic profile of putative toxins isolated from nematocysts of the hydromedusae Olindias sambaquiensis was reported, which included protease and phospholipase enzymes. Here we present the results of a study to experimentally confirm enzymatic activity in extract of O. sambaquiensis tentacles. Specimens of O. sambaquiensis were collected at the coast of São Sebastião, SP, Brazil. A procedure to generate tentacle extract was standardised, yielding high quantities of proteins of different molecular masses. The extract was assayed for the presence of metalloproteases, serine proteases and phospholipase A2 activities using substrates that cover a wide range of each class of these enzymes and also specific substrates for metalloproteases ADAMs and MMPs. The extract showed activity towards all substrates confirming previous proteomic evidence for the presence of these enzymes. In addition, proteolytic activity was also detected by zymography assays on casein and gelatin. However, when comparing these activities to snake venoms, which are rich in proteases and phospholipases, the metalloprotease activity detected was lower than the high levels observed in Bothrops jararaca venom, but levels of serine protease and phospholipase A2 enzyme activity was comparable to the one observed in venoms of Bothrops snakes, known for its strong anti-coagulant and myotoxic activities due to serine proteases and phospholipases A2 molecules, respectively. These data validate the functional properties of proteins characterised previously by proteomics and provide a better understanding of the toxin arsenal of this underexplored venomous animal, indicating the role of active serine proteases and phospholipases A2 in the action of the venom.

As águas-vivas ou medusas estão entre os animais peçonhentos marinhos mais populares. Acidentes envolvendo medusas são comuns e sua toxicidade para humanos pode variar de sintomas leves até envenenamentos fatais em alguns casos. Os venenos de medusas são de importância biotecnológica, apresentando toxinas com atividade antimicrobiana, analgésica e antitumoral. Além disso, enzimas proteolíticas também já foram descritas. Recentemente o perfil proteômico de toxinas putativas dos nematocistos isolados da hidromedusa Olindias sambaquiensis foi caracterizado, identificando a presença de proteases e fosfolipases. Nesse trabalho nós apresentamos os resultados de um estudo que confirma a presença de atividade enzimática no extrato de tentáculos de O. sambaquiensis. Os espécimes foram coletados na costa de São Sebastião, SP, Brasil. O procedimento para obtenção do extrato de tentáculos foi padronizado, rendendo grande quantidade de proteínas de diferentes massas moleculares. O extrato foi avaliado quanto a presença de atividade de metaloproteases, serino proteases e fosfolipases A2, utilizando substratos genéricos para essas enzimas e também substratos específicos para as metaloproteases do tipo ADAMs e MMPs. O extrato apresentou atividade sobre todos os substratos, confirmando evidências proteômicas anteriores. Além disso, a atividade proteolítica também foi detectada por ensaios de zimografia em caseína e gelatina. Quando comparamos essas atividades com venenos de serpentes, que são abundantes em proteases e fosfolipases, a atividade de metaloproteases obtida foi bem menor que os altos índices demonstrados pelo veneno de Bothrops jararaca, entretanto, as atividades observadas para serino proteases e fosfolipases A2 foram comparáveis à atividade observada em venenos de serpentes Bothrops, conhecidas pela sua forte atividade anticoagulante e miotóxica devido a presença de serino proteases e fosfolipases A2, respectivamente. Esses resultados validam as propriedades funcionais das proteínas caracterizadas previamente pelo proteoma e fornecem um melhor entendimento do arsenal tóxico desse animal peçonhento pouco explorado, indicando o papel das serino proteases e fosfolipases A2 na ação do veneno.

RESUMO

Avanços dos conhecimentos moleculares na última década têm permitido a identificação de proteínas podocitárias que atuariam como alvos antigênicos na glomerulonefrite membranosa (GNM). Estudos envolvendo anticorpos contra estruturas podocitárias tem promovido o conceito autoimune da forma idiopática desta glomerulopatia. Neste contexto, o receptor de fosfolipase A2 do tipo M (PLA2R) tem merecido destaque como o primeiro e mais importante autoantígeno descrito na GNM idiopática humana. A presença do anticorpo anti-PLA2R tem sido destacada entre 70% e 89% de portadores da GNM idiopática, diferenciando das formas secundárias. Diversos estudos têm sugerido a detecção do anti-PLA2R como diagnóstico e apontado a correlação de seus níveis circulantes com a atividade clínica e resposta terapêutica. Entretanto, a coexistência de outros autoanticorpos sugere uma complexa via patogênica envolvendo diferentes antígenos podocitários. Estudos adicionais são necessários para esclarecer o tempo de aparecimento e o papel de cada anticorpo antipodócito no diagnóstico e progressão da GNM.

During the last decade, several major breakthroughs have led to the identification of human podocyte membrane antigens. Experimental involving antipodocyte antibodies in human membranous nephropathy (MN) have opened a new line of thinking about this disease, relating as an autoimmune kidney disease. In this setting, the M-type phospholipase A2 receptor (PLA2R) was identified as the first major antigen target in human primary MN. Studies have demonstrated anti-PLA2R antibodies against PLA2R ranging from 70 to 89% in patients with MN, but not in those with secondary MN. It has been suggested that the serum level of anti-PLA2R could be used for the diagnosis of idiopathic MN and for the monitoring of response to treatment. However, the coexistence of autoantibodies suggests a complex pathogenic pathway that involves different podocyte targets. New experimental models are needed to elucidate the appearance time and the role of each anti-podocyte antibody in MN development and progression.

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RESUMO

The venom of the Loxosceles sp spiders comprises a mix of diverse toxins which results in an intense local inflammatory reaction, promotes dermonecrotic skin lesion, platelet aggregation, hemolytic anemia, and acute renal failure in rare cases. Among the toxins found in the venom, the phospholipases D (PLDs) also called dermonecrotic toxins, are the most important and well-studied proteins in the venom, since they assemble the main effects observed in loxoscelism. Despite the importance of these toxins, the biological analyses of PLDs are hampered by their small amount obtained in the venom. Therefore, the strategy of cloning and expression of these toxins in recombinant form in the bacterial system has been widely used and it is currently an important approach to obtain a huge amount of these molecules and to study their biological effects. However, despite the importance of Loxosceles gaucho venom, until now, any PLDs from this specie was isolated, cloned or expressed in a recombinant form. Thereby, in this work, we showed the cloning of cDNA that codifies a PLD from L. gaucho venom gland in pAE plasmid. The recombinant protein, named LgRec1 was produced in E. coli and then purified by IMAC, that resulted in a single band with molecular weight of 32kDa and a yield of 3.2 mg/L for culture medium. Analyzes of biological activity of this toxin showed that is able to promote local reaction (edema, erythema, bruising and pallor) and dermonecrosis; induce platelet aggregation; hydrolyze sphingomyelin and cause hemolysis. Neutralization assays using antibodies produced in rabbits to LgRec1 showed to be effective in inhibiting the local reaction (~ 65%) and dermonecrosis (~ 100%) evoked by whole venom, this indicates a potential use of these antibodies in neutralizing the toxic effects of envenomation. Therefore, the data presented in this work could help us understand the mechanism of action of PLDs in the envenomation caused by Loxosceles spider genus.

O veneno de aranhas Loxosceles compreende uma mistura de diversas toxinas que induz uma intensa reação inflamatória local, promove lesão dermonecrótica, agregação plaquetária, anemia hemolítica e insuficiência renal aguda em casos raros. Entre as várias toxinas encontradas no veneno, as fosfolipases D (FLD), também denominadas de toxinas dermonecróticas, são as mais importantes e mais bem estudadas, uma vez que albergam os principais efeitos observados no loxoscelismo. Apesar de sua importância, a análise biológica de FLDs é dificultada pela quantidade reduzida de veneno obtido. Assim, a estratégia de clonagem e expressão destas toxinas, na forma recombinante em sistema bacteriano, tem sido amplamente empregada e é atualmente uma abordagem muito importante para obter grande quantidade destas toxinas no sentido de estudar os seus efeitos biológicos. Contudo, apesar da importância do veneno de Loxosceles gaucho, até o presente momento nenhuma FLDs desta espécie foi isolada, clonada ou expressa na forma recombinante. Deste modo, mostramos neste trabalho, a clonagem do cDNA que codifica uma FLD da glândula de veneno de L. gaucho em vetor pAE. A proteína recombinante, denominada de LgRec1, foi produzida em E. coli e purificada por IMAC, resultando em uma banda única com massa molecular de 32KDa e rendimento de 3,2 mg/L cultura. Análises de atividade biológica desta toxina mostrou que ela é capaz de promover reação local (edema, eritema, equimose e palidez) e dermonecrose; induzir agregação plaquetária; hidrolizar esfingomielina e promover hemólise. Testes de neutralização utilizando anticorpos produzidos em coelhos contra a LgRec1, mostraram-se eficazes em inibir a reação local (~ 65%) e a dermonecrose (~ 100%) promovidas pelo veneno, indicando um potencial para o uso destes anticorpos na neutralização dos efeitos tóxicos do veneno total. Dessa forma, os dados apresentados neste trabalho poderão colaborar para a compreensão dos mecanismos de ação das FLDs no envenenamento provocado pelas aranhas do gênero Loxosceles.