RESUMO
BACKGROUND: Owing to their minimal size, high production yield, versatility and robustness, the recombinant variable domains (nanobodies) of camelid single chain antibodies are valued affinity reagents for research, diagnostic, and therapeutic applications. While their preparation against purified antigens is straightforward, the generation of nanobodies to difficult targets such as multi-pass or complex membrane cell receptors remains challenging. Here we devised a platform for high throughput identification of nanobodies to cell receptor based on the use of a biotin handle. METHODS: Using a biotin-acceptor peptide tag, the in vivo biotinylation of nanobodies in 96 well culture blocks was optimized allowing their parallel analysis by flow cytometry and ELISA, and their direct use for pull-down/MS target identification. RESULTS: The potential of this strategy was demonstrated by the selection and characterization of panels of nanobodies to Mac-1 (CD11b/CD18), MHC II and the mouse Ly-5 leukocyte common antigen (CD45) receptors, from a VHH library obtained from a llama immunized with mouse bone marrow derived dendritic cells. By on and off switching of the addition of biotin, the method also allowed the epitope binning of the selected Nbs directly on cells. CONCLUSIONS: This strategy streamlines the selection of potent nanobodies to complex antigens, and the selected nanobodies constitute ready-to-use biotinylated reagents. GENERAL SIGNIFICANCE: This method will accelerate the discovery of nanobodies to cell membrane receptors which comprise the largest group of drug and analytical targets.
Assuntos
Células Dendríticas/imunologia , Receptores de Superfície Celular/imunologia , Anticorpos de Cadeia Única/imunologia , Anticorpos de Domínio Único/imunologia , Animais , Biotina/imunologia , Antígeno CD11b/imunologia , Antígenos CD18/imunologia , Camelídeos Americanos , Linhagem Celular , Técnicas de Visualização da Superfície Celular/métodos , Células Cultivadas , Células Dendríticas/metabolismo , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Citometria de Fluxo , Imunização/métodos , Antígenos Comuns de Leucócito/imunologia , Camundongos Endogâmicos BALB C , Peptídeos/imunologia , Reprodutibilidade dos Testes , Espectrometria de Massas por Ionização e Dessorção a Laser Assistida por MatrizRESUMO
Antecedentes: La rabia humana y animal es frecuente en Colombia. Su diagnóstico requiere inmnofluorescencia directa (IFD) e inoculación intracerebral al ratón (IIC), condiciones que alcanzan pocos laboratorios. La histopatología muestra cuerpos de Negri entre el 40 por ciento al 87 por ciento de los casos. Nuestro objetivo es desarrollar y determinar la utilidad del método avidina-biotina-peroxidasa (ABP) en tejido fijado en formol e incluido en parafina. Materiales y métodos: Se estandarizó la técnica ABP usando muestras de encéfalo con rabia confirmada por IFD, IIC al ratón o histopatología. La técnica se pudo a prueba estudiando cortes de 100 encéfalos humanos o de animales sospechosos de tener rabia. Se escogieron encéfalos incluídos en parafina o mantenidos en congelación durante años, SNC fresco de ratón inoculado con virus fijo y cerebros normales o con otras encefalitis virales. Se determinó la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad del método. Resultados: La técnica de ABP muestra sensibilidad mayor o igual a .80 y especificidad mayor o igual a .97. La concordancia con respecto a la IIC y a la IFD dio resultados entre substanciales y casi perfectos, según la escala de Landys y Koch, niveles altos que también se obtienen al evaluar la reproducibilidad intraobservador e interobservador. La técnica fue siempre mejor que la HE. Conclusiones: La técnica es útil, confiable, reproducible, fácil de realizar y funciona bien inclusive en encéfalos con pobre preservación tisular. Merece incluirse entre los procedimientos de rutina o alternativos en el dignóstico de la rabia humana y animal