RESUMO
El síndrome de ojo seco (SOS) constituye una de las patologías oculares más frecuentes y con mayor repercusión en la calidad de vida de pacientes en el mundo actual. A su vez, dado cambios en los hábitos como el mayor uso de pantallas, la mayor polución y el envejecimiento poblacional hacen que la proyección sea en aumento. Se estima que el 10% de los SOS son pacientes con síndrome de Sjögren (SS). Este puede ser primario o secundario cuando se encuentra asociado a otras enfermedades del tejido conectivo como el lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumatoide (AR) o la esclerosis sistémica (ES). El SOS secundario a SS (SS-SOS) nos resulta de particular interés por ser generalmente severo y de difícil tratamiento. El suero autólogo (SA) constituye una herramienta poco utilizada en nuestro medio hasta la realización de este proyecto. Sus componentes, que incluyen factores de crecimiento epitelial y vitamina A constituyen bloques fundamentales del mantenimiento de las barreras epiteliales haciéndolo una terapia prometedora y accesible. El SS es la tercera enfermedad reumática más prevalente junto con AR y el LES. Se estima que la prevalencia del SSP va del 0.1 al 4.8% de la población dependiendo de la edad, y 90% de estos pacientes son mujeres. A pesar de su alta prevalencia, aún hay gran desconocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el SS-SOS. Tanto la inmunidad innata como adaptativa participan en la patogenia del SOS asociado a SS. Estudios previos encontraron que tanto un perfil Th1 como Th17 serían los principales actores. Por este motivo, elegimos el estudio de las citoquinas IL-17 e IL-22 las cuales son las principales citoquinas efectoras de este perfil linfocitario. Estas citoquinas mantienen la integridad de la barrera epitelial estimulando la formación de proteínas que conforman las uniones estrechas.En especial IL-22 tiene un rol importante en la supervivencia y proliferación celular. Por su parte IL-17 tendría un rol estimulando la producción de péptidos antimicrobianos y quimioquinas que atraen leucocitos a la zona afectada cuando la barrera epitelial es penetrada. En la escasa literatura publicada se ha observado que los niveles de IL-17 e IL22 se encuentran aumentados significativamente en pacientes con SS-SOS con relación a los no SS y a los controles sanos. A su vez, el nivel de estas citoquinas se correlacionaba positivamente con el cuestionario de queratopatía del índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI por su sigla en inglés) y negativamente con el tiempo de rotura del film lagrimal (TBUT por su sigla en inglés) y el resultado de la prueba de Schirmer. Debemos destacar que estos resultados fueron vistos en un único estudio que incluyó un pequeño número de pacientes. Las mucinas jugarían un rol fundamental en la homeostasis de la superficie ocular (SO). En particular las mucinas transmembrana MUC1, MUC4 y MUC16 estarían involucradas en la activación de factores de transcripción de citoquinas proinflamatorias. Nuestra hipótesis inicial era que se podría observar una disminución en la expresión de estas mucinas en relación con el daño de la SO. Esta hipótesis se basó en el conocido rol protector que las mucinas 12 juegan normalmente en las superficies epiteliales, atrapando agentes patógenos y su estudiada naturaleza inmunorreguladora. A lo largo de este trabajo de doctorado PROINBIO, se utilizó una combinación de diversas estrategias experimentales y clínicas para estudiar la superficie ocular en pacientes con síndrome de Sjögren (SS) y síndrome de ojo seco (SOS) y la correlación de estos hallazgos con la clínica del paciente.Para el desarrollo de este proyecto de investigación, conseguimos articular un servicio dirigido a los pacientes con SOS con la participación de un equipo multidisciplinario integrado por médicos oftalmólogos pertenecientes a la cátedra de oftalmología (valoración- seguimiento - indicación terapéutica), hemoterapia (desarrollo del colirio de suero autólogo) y unidad de enfermedades autoinmunes (captación de los pacientes con síndrome de Sjögren primario o secundario) del Hospital de Clínicas en Montevideo, Uruguay. Al mismo tiempo, desarrollamos y pusimos a punto la toma de biopsias de células conjuntivales mediante impresión conjuntival. Este procedimiento se había realizado anteriormente en nuestro medio, pero nunca para el estudio posterior con técnica de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real). También conseguimos sistematizar el correcto almacenamiento y procesamiento de las muestras para la realización de esta técnica. Esto facilitará en el futuro continuar con el estudio de nuevos marcadores en esta y otras patologías de la SO. Nuestros resultados nos permitieron arribar a las siguientes conclusiones: Determinamos la primera estimación de prevalencia de SOS en una población de pacientes con diagnóstico de otras patologías autoinmunes en nuestra población la cual fue discretamente menor a la reportada en la literatura. Esta fue de 22% de los pacientes, constituyendo la primera estimación en Uruguay de SOS en pacientes con patología autoinmune. Logramos medir la expresión de las tres principales mucinas transmembrana de la SO en nuestro grupo de pacientes estudiados e individuos sanos. Contrario a nuestra hipótesis, observamos un aumento significativo de la expresión de MUC1 y MUC4 en nuestro grupo de pacientes con SOS.A pesar de que es conocido el rol fundamental de las mucinas en mantener la homeostasis de la SO, se ha descrito el aumento en la expresión de MUC1 y MUC4 frente al daño inflamatorio o en casos de neoplasias tanto en el epitelio digestivo como respiratorio. Detectamos una diferencia en la expresión de estas mucinas entre pacientes con SSP donde observamos un aumento de las tres mucinas de estudio (MUC1, MUC4 y MUC16) y SSS donde únicamente MUC1 se vio significativamente elevada. Asimismo, correlacionamos estos hallazgos con la clínica (síntomas y signos de ojo seco) observando que MUC4 correlaciona significativamente tanto con menor producción del film lagrimal como con un mayor grado de queratopatía superficial. La correlación de MUC4 con los síntomas de SOS no fue significativa lo cual pensamos sí se observaría probablemente incluyendo un mayor número de pacientes en el estudio. Por otra parte, MUC1 y MUC16 se correlacionaron positivamente con una presencia de síntomas más severos de SOS pero su correlación con los signos clínicos de SOS no llegó al nivel de significancia excepto en el caso de MUC1 con relación al grado de queratopatía. Evaluamos la expresión de citoquinas proinflamatorias del perfil Th17 como son IL-17 e IL-22. Observamos como la IL 22 se correlaciona con la expresión de MUC16, la cual a su vez aumenta en pacientes con mayor sintomatología de SOS. Encontramos una correlación significativa entre la expresión de ambas citoquinas como era esperable ya que ambas son citoquinas que corresponden a un mismo perfil de respuesta linfocitaria. No pudimos reproducir los resultados vistos en la literatura, aunque escasa, la cual reporta que los pacientes con SOS presentan un aumento de estas citoquinas en relación a una mayor severidad clínica del SS-SOS.En nuestro estudio no observamos diferencia entre nuestro grupo de pacientes y el grupo control ni una correlación con los síntomas o signos del SOS. Analizamos la expresión de MUC1, MUC4 y MUC16 comparando el grupo de pacientes con SS tratados con inmunomoduladores versus los no tratados observando una diferencia interesante entre estos dos grupos. Mientras ambos grupos sobre expresan MUC1. Los pacientes en tratamiento presentan un aumento de MUC4 y no de MUC16 y lo inverso se observa en los pacientes no tratados. Evidenciamos la mejoría sintomática del tratamiento de estos pacientes con suero autólogo al 20% el cual es una opción terapéutica disponible en nuestro medio que está subutilizada por la falta de evidencia clínica hasta el momento. Estos resultados son un sustento objetivo de la efectividad del tratamiento para este grupo de pacientes. En suma, este trabajo constituye una aproximación a comprender como varia la expresión a nivel de ARN mensajero de mucinas transmembranarias específicas y su asociación con citoquinas de perfil Th17, así como síntomas y signos clínicos del SS-SOS. Constituye un gran paso inicial a la caracterización molecular de la SO de estos pacientes y con esta la potencialidad de desarrollar terapias dirigidas. Según nuestro saber y entender, éste constituye el primer trabajo de estas características en nuestro medio y nos brinda más información de la prevalencia y características de estos pacientes en Uruguay. La puesta a punto de la técnica de impresión conjuntival, conocida en el mundo, pero no utilizada en nuestro país habitualmente para la extracción de ARN, abre las puertas para ampliar nuestras investigaciones focalizándonos en otras moléculas posiblemente cruciales en el desarrollo de SOS como por ejemplo el estudio de glicosil transferasas.
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Humanos , Síndrome de Sjogren , Citocinas/genética , Mucina-1/genética , Antígeno Ca-125/genética , Mucina-4/genética , Dissertação AcadêmicaRESUMO
BACKGROUND: The success of HER2-positive (HER2+) breast cancer treatment with trastuzumab, an antibody that targets HER2, relies on immune response. We demonstrated that TNFα induces mucin 4 (MUC4) expression, which shields the trastuzumab epitope on the HER2 molecule decreasing its therapeutic effect. Here, we used mouse models and samples from HER2+ breast cancer patients to unravel MUC4 participation in hindering trastuzumab effect by fostering immune evasion. METHODS: We used a dominant negative TNFα inhibitor (DN) selective for soluble TNFα (sTNFα) together with trastuzumab. Preclinical experiments were performed using two models of conditionally MUC4-silenced tumors to characterize the immune cell infiltration. A cohort of 91 patients treated with trastuzumab was used to correlate tumor MUC4 with tumor-infiltrating lymphocytes. RESULTS: In mice bearing de novo trastuzumab-resistant HER2+ breast tumors, neutralizing sTNFα with DN induced MUC4 downregulation. Using the conditionally MUC4-silenced tumor models, the antitumor effect of trastuzumab was reinstated and the addition of TNFα-blocking agents did not further decrease tumor burden. DN administration with trastuzumab modifies the immunosuppressive tumor milieu through M1-like phenotype macrophage polarization and NK cells degranulation. Depletion experiments revealed a cross-talk between macrophages and NK cells necessary for trastuzumab antitumor effect. In addition, tumor cells treated with DN are more susceptible to trastuzumab-dependent cellular phagocytosis. Finally, MUC4 expression in HER2+ breast cancer is associated with immune desert tumors. CONCLUSIONS: These findings provide rationale to pursue sTNFα blockade combined with trastuzumab or trastuzumab drug conjugates for MUC4+ and HER2+ breast cancer patients to overcome trastuzumab resistance.
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Mucina-4 , Neoplasias , Camundongos , Animais , Trastuzumab/farmacologia , Trastuzumab/uso terapêutico , Regulação para Baixo , Mucina-4/genética , Mucina-4/metabolismo , Fator de Necrose Tumoral alfa/metabolismo , Receptor ErbB-2 , Linhagem Celular Tumoral , Terapia de Imunossupressão , Neoplasias/tratamento farmacológicoRESUMO
Angiomatoid fibrous histiocytoma (AFH) is a rarely metastasizing neoplasm that typically occurs in the deep dermis and subcutis of the extremities of young patients, characterized by a t(2;22) translocation involving EWSR1 and CREB1. Because of its distinctive histologic features, the diagnosis of AFH is generally straightforward, although the immunohistochemistry (IHC) findings are relatively nonspecific. We recently encountered a case of primary cranial AFH that showed strong MUC4 IHC expression, which has not yet been reported previously. Prompted by this surprising finding, we investigated MUC4 expression in a series of AFH to evaluate this potential diagnostic pitfall. The expression of ALK by IHC, recently discovered in AFH, was also assessed in this study. We also analyzed EWSR1 rearrangement by fluorescence in situ hybridization using a dual color break-apart probe to confirm the diagnosis. The results showed MUC4 expression in 22.2% of AFH cases (4/18 cases), demonstrating a variable intensity of cytoplasmic staining. Most notably, one of the positive cases showed strong and diffuse expression. ALK IHC expression was observed in 17 of 18 cases (94.4%), usually in a diffuse and strong cytoplasmic pattern. EWSR1 rearrangement was demonstrated by fluorescence in situ hybridization in 81.2% of cases (13 of 16), including all the MUC4-positive cases. Our results indicate that although the significance of MUC4 expression in AFH is unknown, it is important to be aware that a subset of AFH can express the protein by IHC, expanding a variety of MUC4-positive mesenchymal tumors.
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Histiocitoma Fibroso Benigno/metabolismo , Mucina-4/metabolismo , Adolescente , Adulto , Idoso , Quinase do Linfoma Anaplásico/metabolismo , Criança , Pré-Escolar , Feminino , Rearranjo Gênico , Histiocitoma Fibroso Benigno/genética , Humanos , Imuno-Histoquímica , Hibridização in Situ Fluorescente , Masculino , Pessoa de Meia-Idade , Proteína EWS de Ligação a RNA/genéticaRESUMO
BACKGROUND: Invasive micropapillary carcinoma of the breast (IMPC) is a histological tumor variant that occurs with low frequency characterized by an inside-out formation of tumor clusters with a pseudopapillary arrangement. IMPC is an aggressive tumor with poor clinical outcome. In addition, this histological subtype usually expresses human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) which also correlates with a more aggressive tumor. In this work we studied the clinical significance of IMPC in HER2-positive breast cancer patients treated with adjuvant trastuzumab. We also analyzed mucin 4 (MUC4) expression as a novel biomarker to identify IMPC. METHODS: We retrospectively studied 86 HER2-positive breast cancer patients treated with trastuzumab and chemotherapy in the adjuvant setting. We explored the association of the IMPC component with clinicopathological parameters at diagnosis and its prognostic value. We compared MUC4 expression in IMPC with respect to other histological breast cancer subtypes by immunohistochemistry. RESULTS: IMPC, either as a pure entity or associated with invasive ductal carcinoma (IDC), was present in 18.6% of HER2-positive cases. It was positively correlated with estrogen receptor expression and tumor size and inversely correlated with patient's age. Disease-free survival was significantly lower in patients with IMPC (hazard ratio = 2.6; 95%, confidence interval 1.1-6.1, P = 0.0340). MUC4, a glycoprotein associated with metastasis, was strongly expressed in all IMPC cases tested. IMPC appeared as the histological breast cancer subtype with the highest MUC4 expression compared to IDC, lobular and mucinous carcinoma. CONCLUSION: In HER2-positive breast cancer, the presence of IMPC should be carefully examined. As it is often not informed, because it is relatively difficult to identify or altogether overlooked, we propose MUC4 expression as a useful biomarker to highlight IMPC presence. Patients with MUC4-positive tumors with IMPC component should be more frequently monitored and/or receive additional therapies.
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Neoplasias da Mama/mortalidade , Carcinoma Ductal de Mama/mortalidade , Carcinoma Papilar/mortalidade , Mucina-4/metabolismo , Receptor ErbB-2/metabolismo , Trastuzumab/farmacologia , Adulto , Idoso , Antineoplásicos Imunológicos , Biomarcadores Tumorais/metabolismo , Neoplasias da Mama/tratamento farmacológico , Neoplasias da Mama/metabolismo , Neoplasias da Mama/patologia , Carcinoma Ductal de Mama/tratamento farmacológico , Carcinoma Ductal de Mama/metabolismo , Carcinoma Ductal de Mama/patologia , Carcinoma Papilar/tratamento farmacológico , Carcinoma Papilar/metabolismo , Carcinoma Papilar/patologia , Estudos de Casos e Controles , Quimioterapia Adjuvante , Feminino , Seguimentos , Humanos , Pessoa de Meia-Idade , Invasividade Neoplásica , Prognóstico , Receptor ErbB-2/antagonistas & inibidores , Receptor ErbB-2/imunologia , Estudos Retrospectivos , Taxa de SobrevidaRESUMO
PURPOSE: Although trastuzumab administration improved the outcome of HER2-positive breast cancer patients, resistance events hamper its clinical benefits. We demonstrated that TNFα stimulation in vitro induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer cell lines. Here, we explored the mechanism of TNFα-induced trastuzumab resistance and the therapeutic strategies to overcome it. EXPERIMENTAL DESIGN: Trastuzumab-sensitive breast cancer cells, genetically engineered to stably overexpress TNFα, and de novo trastuzumab-resistant tumors, were used to evaluate trastuzumab response and TNFα-blocking antibodies effectiveness respectively. Immunohistochemistry and antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), together with siRNA strategy, were used to explore TNFα influence on the expression and function of its downstream target, mucin 4 (MUC4). The clinical relevance of MUC4 expression was studied in a cohort of 78 HER2-positive breast cancer patients treated with adjuvant trastuzumab. RESULTS: TNFα overexpression turned trastuzumab-sensitive cells and tumors into resistant ones. Histopathologic findings revealed mucin foci in TNFα-producing tumors. TNFα induced upregulation of MUC4 that reduced trastuzumab binding to its epitope and impaired ADCC. Silencing MUC4 enhanced trastuzumab binding, increased ADCC, and overcame trastuzumab and trastuzumab-emtansine antiproliferative effects in TNFα-overexpressing cells. Accordingly, administration of TNFα-blocking antibodies downregulated MUC4 and sensitized de novo trastuzumab-resistant breast cancer cells and tumors to trastuzumab. In HER2-positive breast cancer samples, MUC4 expression was found to be an independent predictor of poor disease-free survival (P = 0.008). CONCLUSIONS: We identified TNFα-induced MUC4 expression as a novel trastuzumab resistance mechanism. We propose MUC4 expression as a predictive biomarker of trastuzumab efficacy and a guide to combination therapy of TNFα-blocking antibodies with trastuzumab. Clin Cancer Res; 23(3); 636-48. ©2016 AACR.
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Antineoplásicos Imunológicos/farmacologia , Neoplasias da Mama/tratamento farmacológico , Resistencia a Medicamentos Antineoplásicos/fisiologia , Regulação Neoplásica da Expressão Gênica , Mucina-4/fisiologia , Proteínas de Neoplasias/análise , Receptor ErbB-2/análise , Trastuzumab/farmacologia , Fator de Necrose Tumoral alfa/fisiologia , Ado-Trastuzumab Emtansina , Animais , Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos , Antineoplásicos Imunológicos/metabolismo , Antineoplásicos Imunológicos/uso terapêutico , Neoplasias da Mama/mortalidade , Neoplasias da Mama/patologia , Linhagem Celular Tumoral , Intervalo Livre de Doença , Resistencia a Medicamentos Antineoplásicos/efeitos dos fármacos , Sinergismo Farmacológico , Feminino , Regulação Neoplásica da Expressão Gênica/efeitos dos fármacos , Humanos , Imunoconjugados/farmacologia , Maitansina/análogos & derivados , Maitansina/farmacologia , Camundongos , Camundongos Nus , Mucina-4/biossíntese , Mucina-4/genética , Proteínas de Neoplasias/antagonistas & inibidores , Interferência de RNA , Receptor ErbB-2/antagonistas & inibidores , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Transdução de Sinais/efeitos dos fármacos , Neoplasias Gástricas/patologia , Trastuzumab/metabolismo , Trastuzumab/uso terapêutico , Fator de Necrose Tumoral alfa/antagonistas & inibidores , Fator de Necrose Tumoral alfa/genética , Fator de Necrose Tumoral alfa/imunologia , Regulação para Cima/efeitos dos fármacos , Ensaios Antitumorais Modelo de XenoenxertoRESUMO
An immunohistochemical analysis was employed to determine the expression of carbohydrate antigens associated to mucins in normal epithelia. Tissue samples were obtained as biopsies from normal breast (18), colon (35) and oral cavity mucosa (8). The following carbohydrate epitopes were studied: sialyl-Lewis x, Lewis x, Lewis y, Tn hapten, sialyl-Tn and Thomsen-Friedenreich antigen. Mucins were also studied employing antibodies against MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC6 and also normal colonic glycolipid. Statistical analysis was performed and Kendall correlations were obtained. Lewis x showed an apical pattern mainly at plasma membrane, although cytoplasmic staining was also found in most samples. TF, Tn and sTn haptens were detected in few specimens, while sLewis x was found in oral mucosa and breast tissue. Also, normal breast expressed MUC1 at a high percentage, whereas MUC4 was observed in a small number of samples. Colon specimens mainly expressed MUC2 and MUC1, while most oral mucosa samples expressed MUC4 and MUC1. A positive correlation between MUC1VNTR and TF epitope (r=0.396) was found in breast samples, while in colon specimens MUC2 and colonic glycolipid versus Lewis x were statistically significantly correlated (r=0.28 and r=0.29, respectively). As a conclusion, a defined carbohydrate epitope expression is not exclusive of normal tissue or a determined localization, and it is possible to assume that different glycoproteins and glycolipids may be carriers of carbohydrate antigens depending on the tissue localization considered.
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Mama/metabolismo , Colo/metabolismo , Antígenos CD15/metabolismo , Boca/metabolismo , Antígenos de Neoplasias/metabolismo , Biópsia , Mama/patologia , Membrana Celular/metabolismo , Membrana Celular/patologia , Colo/patologia , Feminino , Regulação da Expressão Gênica , Humanos , Mucosa Intestinal/metabolismo , Mucosa Intestinal/patologia , Antígenos CD15/genética , Boca/patologia , Mucosa Bucal/metabolismo , Mucosa Bucal/patologia , Mucina-1 , Mucina-2 , Mucina-4 , Mucinas/metabolismo , Mucosa/metabolismo , Mucosa/patologiaRESUMO
Intestinal nematode infection induces marked goblet cell hyperplasia and mucus secretion, but the mechanisms of regulation of the changes still remain to be elucidated. In the present study, epithelial cells were isolated from the rat small intestine at various times after Nippostrongylus brasiliensis infection, and the levels of expression of goblet cell- and mucin glycosylation-related genes were estimated by semi-quantitative reverse transcription (RT)-PCR. Among the genes investigated, mucin core peptide (MUC) 2, sialyltransferase (Siat) 4c and trefoil factor family (TFF) 3 were upregulated as early as 2-4 days post-infection, suggesting that they are associated with an early innate protective response. Seven days post-infection and thereafter, when the nematodes reached maturity, significant upregulation of MUC3, MUC4, resistin-like molecule beta (Relmbeta) and 3O-sulfotransferase (3ST)1 was observed, while 3ST2 expression levels increased after the majority of the worms were expelled from the intestine. Similar alterations of glycosylation-related gene expression were also observed in mast-cell-deficient Ws/Ws rats, suggesting that mast cells in the epithelium are not relevant to the upregulation of these genes. The present finding that the expression level of each goblet cell- or glycosylation-related gene was altered differently during the time course of infection indicates the progression of sequential qualitative changes in the mucus layer after infection.