RESUMO
Epizootiological study of Anaplasma marginale in regions that contain various reservoir hosts, co-existence of rickettsia pathogens, and common vectors is a complicated task. To achieve diagnosis of this rickettsia in cattle and campeiro deer of Brazilian Pantanal, a comparison was made between a real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with intercalating Sybr Green fluorochrome and primers based on msp5 gene of A. marginale; a conventional PCR (C-PCR); and parasitological examination using thin blood smear stained with Giemsa-MayGrunwald. Both PCRs showed good performance in the diagnosis of A. marginale in cattle, and were superior to the parasitological exam. The RT-PCR detected seven positive campeiro deer (16.3%). This rate was significantly higher compared to C-PCR, which identified one animal as positive (2.3%), and also compared to parasitological diagnosis, which did not find any positive animals. The dissociation temperature average of positive reactions in cattle (81.72 ºC ± 0.20) was identical to dissociation temperature found in the cervids (81.72 ºC ± 0.12), suggesting that both animal species were infected with A. marginale. We concluded that RT-PCR can be used for A. marginale diagnosis and in epizootiological studies of cattle and cervids; in spite of the small number of campeiro deer samples, the results indicated that this wildlife species has importance in the Anaplasma epizootiology in the Brazilian Pantanal.
O estudo epizootiológico de Anaplasma marginale em regiões que existem vários reservatórios, co-existência de espécies de riquétsias patógenas e vetores comuns é uma tarefa complicada. Com o objetivo de obter o diagnóstico dessa riquétsia em bovinos e veado campeiro do Pantanal brasileiro foi avaliada uma reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR-TR) com o fluoróforo intercalante de fita dupla de DNA Sybr Green e iniciadores baseados na seqüência do gene msp5 de A. marginale comparando-a a uma PCR convencional (PCR-C) e ao exame parasitológico de esfregaço fino de sangue corado com Giemsa-MayGrunwald. Ambas PCRs apresentaram bom desempenho no diagnóstico de A. marginale nos bovinos, o qual foi superior ao exame parasitológico. O PCR-TR detectou sete veados campeiros positivos (16,3%), o que foi significativamente maior comparado ao PCR-C identificando um animal como positivo (2,3%), e ao exame parasitológico não encontrou nenhum animal positivo. A média da temperatura de dissociação das reações positivas para amostras de bovinos (81,72 ºC ± 0,20) foi idêntica àquelas dos cervídeos ( 81,72 ºC ± 0,12), o que sugere que ambas espécies animais foram infectadas por A. marginale. Concluímos que PCR-TR pode ser utilizada para diagnóstico e estudos epizootiológicos de A. marginale em bovinos e cervídeos. Apesar da pequena amostragem de veado campeiro os resultados indicam que essa espécie de animal selvagem tem importância na epizootiologia do Anaplasma no Pantanal brasileiro.
RESUMO
This investigation was carried out in Brazilian Pantanal: region with important biodiversity. This region's climatic conditions, hydrology and geomorphology as well as the existence of great variety of wild species favor the maintenance of the Leptospira in the environment. The aim of this study was to evaluate IgG ELISA with recombinant protein LipL32 in comparison with microscopic agglutination test (MAT) and additionally contribute to the knowledge of the distribution of the one of most important worldwide zoonotic infection, assessing the seropositivity of bovine leptospirosis in beef cattle herds of Brazilian Pantanal, an important ecological preserved area, where cattle constitute not only the most important economic resource but also the major activity compatible of the conservation of natural resource of the region. Out of 282 samples of cattle serum analyzed, 143 (50.71%) were positive in MAT. The serovar Hardjo (genotypic Hardjoprajitno and Hardjobovis), Wolffi and Ballum showed the largest frequency of reactive samples. In the IgG ELISA rLipL32, 161 samples (57.09%) were positive. This result was higher than obtained by MAT (p 0.001). The sensitivity of the ELISA test was 99.30% and the specificity was 86.33%, based on the MAT. This test was shown to be a more sensitive, specific and accurate test for the diagnosis of bovine leptospirosis compared to the MAT.
Este estudo foi realizado no Pantanal brasileiro: região que apresenta importante biodiversidade. As condições de clima, hidrologia e geomorfologia dessa região, bem como a existência de grande variedade de espécies animais silvestres, favorecem a manutenção da Leptospira no meio ambiente. O objetivo desse estudo foi avaliar o ELISA IgG com proteína recombinante LipL32 em comparação com a soroaglutinação microscópica (SAM) para o diagnóstico sorológico de Leptospira. Adicionalmente, contribuir para o conhecimento da distribuição da leptospirose bovina, uma das mais importantes zoonoses mundialmente distribuída. Foi avaliada a soropositividade para essa bactéria em rebanhos bovinos de corte da região do Pantanal, uma área onde o bovino constitui não apenas o recurso econômico mais importante, como também a principal atividade econômica compatível com a conservação dos recursos naturais da região. Das 282 amostras de soro bovino analisadas, 143 (50,71%) foram positivas na SAM. O sorovar Hardjo (genótipos Hardjoprajitno e Hardjobovis), Wolffi e Ballum apresentaram freqüências altas de amostras reativas. No IgG ELISA rLipL32, 161 amostras (57,09%) foram positivas, apresentando esse teste uma maior soropositividade em relação à SAM (p 0,001). A Sensibilidade do ELISA em comparação com a SAM foi de 99,30% e a especificidade de 86,33%. O IgG ELISA rLipL32 mostrou ser um teste sensível, específico e de alta acurácia para o diagnóstico de leptospirose bovina.
RESUMO
A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma nested-PCR (nPCR) um teste imunoenzimático (ELISA) e a imunodifusão emgel de agar (IDGA) foram utilizados para identificar bovinos Pantaneiros naturalmente infectados pelo vírus da leucemia bovina(BLV), e os resultados dos quatro testes comparados. A concordância entre os testes foi de 86,2%, 70,0% e 62,5%, respectivamentepara ELISA/IDGA, IDGA/PCR e ELISA/PCR. A nPCR amplificou DNA proviral de 12 amostras negativas à PCR e de quatrobovinos com resultados negativos em testes sorológicos; entretanto, não amplificou o DNA proviral de quatro amostras debovinos soropositivos.
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A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma nested-PCR (nPCR) um teste imunoenzimático (ELISA) e a imunodifusão emgel de agar (IDGA) foram utilizados para identificar bovinos Pantaneiros naturalmente infectados pelo vírus da leucemia bovina(BLV), e os resultados dos quatro testes comparados. A concordância entre os testes foi de 86,2%, 70,0% e 62,5%, respectivamentepara ELISA/IDGA, IDGA/PCR e ELISA/PCR. A nPCR amplificou DNA proviral de 12 amostras negativas à PCR e de quatrobovinos com resultados negativos em testes sorológicos; entretanto, não amplificou o DNA proviral de quatro amostras debovinos soropositivos.
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The direct fluorescent antibody test (DFAT) for the diagnosis of Bovine Genital Campylobacteriosis was assessed for its detection limit, observer effect, sensitivity and specificity. In addition, the specificity of the fluorescent conjugate was tested against Campylobacter sp, Arcobacter sp, Helicobacter sp, E. coli and other bacteria from the preputial flora. Ten - fold dilutions of C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 in PBS or preputial washings with or without centrifugation were used. All experiments were done in duplicate by three observers. Positive and negative controls were included in each assay. The detection limits of DFAT were 10(4) CFU/ ml for PBS and non - centrifuged preputial washings and 10(2) CFU/ ml for centrifuged preputial washings. There was no observer effect. The sensitivity and specificity of DFAT were 92.59% and 88.89%, respectively. The DFAT was observed to be sensitive, specific and the effect of experienced observers was minimal on test performance.